| Centromere Chromosome Orientation Fluorescent in situ Hybridization (Cen-CO-FISH) Detects Sister Chromatid Exchange at the Centromere in Human Cells
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Author:
Date:
2018-04-05
[Abstract] Human centromeres are composed of large tandem arrays of repetitive alpha satellite DNA, which are often sites of aberrant rearrangement in cancers (Mitelman et al., 1997; Padilla-Nash et al., 2001). To date, annotation of the human centromere repetitive sequences remains incomplete, greatly hindering in-depth functional studies of these regions essential for chromosome segregation. In order to monitor sister chromatid exchange happening at the centromere (C-SCE) due to recombination and mutagenic events, I have applied the Chromosome-Orientation Fluorescence in situ Hybridization (CO-FISH) technique to centromeres (Cen-CO-FISH) in human cells. This hybridization-based method involves (1) the incorporation of nucleotide analogs through a single round of ...
[摘要] 人类着丝粒由重复的α卫星DNA的大串联阵列组成，这些细胞通常是癌症中异常重排的位点（Mitelman等人，1997; Padilla-Nash等人 >，2001）。迄今为止，对人类着丝粒重复序列的注释仍然不完整，极大地妨碍了这些区域对染色体分离至关重要的深入功能研究。为了监测由于重组和诱变事件而在着丝粒（C-SCE）上发生姊妹染色单体交换，我将染色体定位荧光原位杂交（CO-FISH）技术应用于着丝粒（ Cen-CO-FISH）在人类细胞中的表达。这种基于杂交的方法包括（1）通过单轮复制掺入核苷酸类似物，（2）新合成的DNA链的酶消化和（3）单链探针的后续杂交，在不存在变性步骤的情况下。所产生的信号允许基于DNA的5'-3'方向性差异地标记每个姊妹染色单体，并评估指示C-SCE的异常染色模式。应用于人类着丝粒的Cen-CO-FISH方法揭示，人类着丝粒确实在循环细胞中发生重组，导致C-SCE，并且在经历衰老的癌细胞系和原代细胞中着丝粒不稳定性增强（Giunta和Funabiki，2017）。在这里，我介绍了人类细胞中Cen-CO-FISH方法的制备，实验程序和数据采集的详细方案。它还包括该技术的概念性概述，以及代表性图像和评分准则的示例。 Cen-CO-FISH是促进着丝粒重复探索的有用工具。
【背景】人类基因组计划于2003年标记为完成，但它遗漏了超过10％的人类重复DNA（de ...
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| Cell-free Generation of COPII-coated Procollagen I Carriers
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Author:
Date:
2017-11-20
[Abstract] The aim of this protocol is to generate COPII-coated procollagen I (PC1) carriers in a cell-free reaction. The COPII-coated PC1 carriers were reconstituted from donor membrane, cytosol, purified recombinant COPII proteins, and nucleotides. This protocol describes the preparation of donor membrane and cytosol, the assembly of the reaction, and the isolation and detection of reconstituted COPII-coated carriers. This cell-free reaction can be used to test conditions that stimulate or suppress the packaging of PC1 into COPII-coated carriers.
[摘要] 该协议的目的是在无细胞反应中产生COPII包被的前胶原I（PC1）载体。 COPII包被的PC1载体由供体膜，胞质溶胶，纯化的重组COPII蛋白和核苷酸重构。 该方案描述了供体膜和细胞溶胶的制备，反应的组装，以及复制的COPII包被的载体的分离和检测。 该无细胞反应可用于测试刺激或抑制PC1包装成COPII包被的载体的条件。
【背景】外壳蛋白复合体II（COPII）在从内质网（ER）途径到高尔基体的运输中起着至关重要的作用。来自ER的货物运输所需的基因在酵母的基因研究中被发现，并且借助于添加有纯化组分的无细胞囊泡萌芽反应来阐明囊泡出芽所需基因的蛋白质产物的精确作用（Novick 1981; Kaiser等人，1990; Barlowe等人，1994）。开发了类似的反应来检测COPII在培养的哺乳动物细胞中来自ER的货物运输中的作用（Kim等人，2005）。哺乳动物COPII包被的囊泡直径大约为80-100nm，似乎太小以至于不能容纳诸如刚性的300nm前胶原I（PC1）三股螺旋杆的大分泌性货物。尽管可能的尺寸差异，COPII对于包括PC1在内的大型货物的分泌是必不可少的（Boyadjiev等人，2006）。最近，我们报道了通过随机光学重建显微镜（STORM），相关光电子显微镜（CLEM）和活细胞成像（Gorur ...
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