| Optogenetic Tuning of Protein-protein Binding in Bilayers Using LOVTRAP
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Author:
Date:
2020-09-05
[Abstract] Modern microscopy methods are powerful tools for studying live cell signaling and biochemical reactions, enabling us to observe when and where these reactions take place from the level of a cell down to single molecules. With microscopy, each cell or molecule can be observed both before and after a given perturbation, facilitating better inference of cause and effect than is possible with destructive modes of signaling quantitation. As many inputs to cell signaling and biochemical systems originate as protein-protein interactions near the cell membrane, an outstanding challenge lies in controlling the timing, location and the magnitude of protein-protein interactions in these unique environments. Here, we detail our procedure for manipulating such spatial and temporal protein-protein ...
[摘要] [摘要] 现代显微镜方法是研究活细胞信号转导和生化反应的强大工具，使我们能够观察这些反应的时间和位置，从细胞水平到单个分子。利用显微镜，可以在给定的扰动之前和之后观察每个细胞或分子，比起破坏性的信号定量方法，可以更好地推断因果关系。由于细胞信号传导和生化系统的许多输入源于细胞膜附近的蛋白质-蛋白质相互作用，因此一个巨大的挑战在于控制时间，位置 以及这些独特环境中蛋白质与蛋白质相互作用的程度。在这里，我们详细介绍了在封闭的显微镜系统中使用这种基于时空的蛋白质-蛋白质相互作用系统，在支持的脂质双分子层上使用基于LOVTRAP的光反应性蛋白质-蛋白质相互作用系统的程序。系统可以在几秒钟内做出响应，并且可以将细节图案化到1微米级别。我们使用了该技术来解锁T细胞信号传导的基本方面，并且该方法可推广到许多其他细胞信号传导和生化环境。
背景技术细胞信号传导和细胞生物学中的问题通常集中在细胞如何感知和响应其环境上。进行这些细胞决定的信号级联反应包含的蛋白质可以在几秒钟到几分钟的时间内将纳米级移动到微米级。某些常用方法，例如蛋白质印迹，qPCR ...
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| Preparation of Cell-free Synthesized Proteins Selectively Double Labeled for Single-molecule FRET Studies
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Author:
Date:
2018-06-20
[Abstract] Single-molecule FRET (smFRET) is a powerful tool to investigate molecular structures and conformational changes of biological molecules. The technique requires protein samples that are site-specifically equipped with a pair of donor and acceptor fluorophores. Here, we present a detailed protocol for preparing double-labeled proteins for smFRET studies. The protocol describes two cell-free approaches to achieve a selective label scheme that allows the highest possible accuracy in inter‐dye distance determination.
[摘要] 单分子FRET（smFRET）是研究生物分子的分子结构和构象变化的有力工具。 该技术需要蛋白质样品，该样品是特定位点配有一对供体和受体荧光团的。 在这里，我们提供了一个制备smFRET研究的双标记蛋白的详细方案。 该协议描述了两种无细胞方法来实现选择性标记方案，其允许在染料间距离确定中具有最高可能的准确性。
【背景】单分子FRET（smFRET）是结构生物学中最重要的工具之一，特别是用于分析蛋白质的结构和功能构象变化（Michalet等人，2006; Roy等人。，2008; Sustarsic和Kapanidis，2015）。然而，smFRET的广泛应用在许多情况下受限于合适的蛋白质样品的精细生产。这些蛋白质需要配备两个荧光团，位点特异性连接在蛋白质结构内的不同位置。
经典的基于细胞的蛋白质生产需要一系列耗时的步骤，可以通过使用无细胞蛋白质合成（CFPS）系统来克服，允许更快且直接地生产和选择适当的双标记蛋白质。此外，CFPS的另一个优点是由于几类蛋白质如蛋白酶或膜蛋白对活细胞或其他原因有毒，难以在细胞中表达，可以在CFPS系统中成功合成。最后，CFPS是专注于光谱技术如smFRET的实验室的理想工具，因为细胞培养不是必需的，并且不必考虑重组生物的安全规定。
尽管smFRET所需的样本量本质上很低，但迄今为止，在smFRET研究中，CFPS尚未被标准地用于生产样本。这主要是由于与基于细胞的系统相比蛋白质产量低得多，并且缺乏适当的无细胞方法，其允许适当量的双标记蛋白质的方便合成。然而，正如我们的小组所表明的那样，得益于更高效的正交标记方案（Sadoine ...
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