| Expression and Purification of Yeast-derived GPCR, Gα and Gβγ Subunits for Structural and Dynamic Studies
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Author:
Date:
2021-02-20
[Abstract] In the last several years, as evidence of a surged number of GPCR-G complex structures, the expressions of GPCRs and G proteins for structural biology have achieved tremendous successes, mostly in insect and mammalian cell systems, resulting in more than 370 structures of over 70 GPCRs have been resolved. However, the challenge remains, particularly in the conformational transition and dynamics study area where a much higher quantity of the receptors and G proteins is required even in comparison to X-ray and cryo-EM (5 mg/ml, 3 μl/sample) when NMR spectroscopy (5 mg/ml, 250 μl /sample) is applied. As a result, the expression levels of the insect and mammalian systems are also difficult to meet this demand, not to mention the prohibitive cost of producing GPCRs and G proteins using ...
[摘要] [摘要]在过去的几年中，作为GPCR-G复杂结构数量激增的证据，用于结构生物学的GPCR和G蛋白的表达已取得了巨大的成功，主要是在昆虫和哺乳动物细胞系统中，导致了370多个已解决了70多个GPCR的结构。但是，挑战仍然存在，特别是在构象转变和动力学研究领域，即使与X射线和冷冻EM相比（5 mg / ml，3μl /样品），也需要大量的受体和G蛋白。当应用NMR光谱法（5 mg / ml，250μl /样品）时。结果，i的表达水平 nsect和哺乳动物系统也很难满足这一需求，更不用说使用绝大多数系统使用这些系统生产GPCR和G蛋白的成本高昂了。因此，需要探索一种具有广泛适用性的有效，负担得起的实用方法。毕赤酵母表达系统已在GPCR制备中显示出其希望，并具有其他真核表达系统无法比拟的许多优点。在该系统中表达的GPCR价格便宜，易于操作，并且能够进行同位素标记。在此，我们提出最近开发并在我们的实验室升级的相关协议，包括表达和纯化的毕赤酵母衍生GPCR以G沿α和G βγ蛋白。我们预期这些协议将促进GPCR及其复合物的构象转变和动力学研究。
[背景] G蛋白偶联受体（GPCR）是最大的膜蛋白家族，在许多（病理）生理活动中起着关键作用。GPCR的或它们的效应物的功能障碍会导致各种病症，包括神经变性疾病，癌症，和慢性炎症（Overington等人，2006） ...
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| Generation of Gene Knockout and Gene Replacement with Complete Removal of Full-length Endogenous Transcript Using CRISPR-Trap
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Author:
Date:
2018-10-20
[Abstract] This protocol describes the application of the CRISPR-Trap from designing of the gene targeting strategy to validation of successfully edited clones that was validated on various human cell lines, among them human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). The advantage of CRISPR-Trap over conventional approaches is the complete removal of any endogenous full-length transcript from the target gene. CRISPR-Trap is applicable for any target gene with no or little coding sequence in its first exon. Several human cell lines and different genes have so far been edited successfully with CRISPR-Trap.
[摘要] 该协议描述了CRISPR-Trap从设计基因靶向策略到验证成功编辑的克隆的应用，所述克隆在各种人细胞系上得到验证，其中人类诱导的多能干细胞（hiPSC）。 CRISPR-Trap优于常规方法的优点是从靶基因完全去除任何内源全长转录物。 CRISPR-Trap适用于在其第一个外显子中没有编码序列或编码序列很少的任何靶基因。 到目前为止，已经使用CRISPR-Trap成功编辑了几种人细胞系和不同基因。
【背景】CRISPR / Cas9技术的出现促进了基因敲除和基因编辑的基因组靶向。执行敲除的常规方法依赖于引入移码导致过早终止密码子（PTC），截短开放阅读框（ORF）以及随后通过无义介导的mRNA衰变（NMD）降解靶基因的转录物。 。这种方法的一个可能的缺陷是全长转录物，其可以逃避NMD并产生具有残余或甚至显性负功能的C末端截短蛋白。该协议提出了CRISPR-Trap，这是我们最近建立的一种方法（Reber et al。>，2018），成功编辑后将阻止从靶基因位点表达任何全长转录本（图1）。简而言之，这种方法针对CRISPR / ...
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| Studying the Mechanisms of Developmental Vocal Learning and Adult Vocal Performance in Zebra Finches through Lentiviral Injection
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Date:
2018-09-05
[Abstract] Here we provide a detailed step-by-step protocol for using lentivirus to manipulate miRNA expression in Area X of juvenile zebra finches and for analyzing the consequences on song learning and song performance. This protocol has four parts: 1) making the lentiviral construct to overexpress miRNA miR-9; 2) packaging the lentiviral vector; 3) stereotaxic injection of the lentivirus into Area X of juvenile zebra finches; 4) analysis of song learning and song performance in juvenile and adult zebra finches. These methods complement the methods employed in recent works that showed changing FoxP2 gene expression in Area X with lentivirus or adeno-associated virus leads to impairments in song behavior.
[摘要] 在这里，我们提供了一个详细的逐步协议，用于使用慢病毒操纵幼年斑胸草雀X区的miRNA表达，并分析对歌曲学习和歌曲表现的影响。 该方案有四个部分：1）使慢病毒构建体过表达miRNA miR-9; 2）包装慢病毒载体; 3）将慢病毒立体定位注入少年斑胸草雀X区; 4）青少年和成年斑马雀的歌曲学习和歌曲表演分析。 这些方法补充了近期工作中使用的方法，这些方法显示，在区域X中用慢病毒或腺相关病毒改变 FoxP2 基因表达导致歌曲行为的损害。
【背景】具有良好特征的歌曲行为和基础神经回路的斑胸草雀提供了独特的动物模型来研究声音通信和相关感觉 - 运动学习的神经机制。近年来，一些实验室开始使用病毒载体来操纵斑胸草雀脑中的基因表达并研究其功能后果。这些努力通过对 FoxP2 基因的研究得到了最好的说明，该基因编码叉头盒p2转录因子。 FoxP2蛋白控制着数百个在神经系统发育中起重要作用的下游基因的表达。人类 FoxP2 基因的突变导致言语和语言障碍（Lai et al。，2001）。在鸣禽中，斑马雀X区域的 FoxP2 基因的敲除或过表达，对于声乐学习至关重要的基底神经节核，严重损害了歌曲的行为（Haesler et al。， 2007; Murugan et al。，2013; Heston and ...
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