| Real-time Fluorescence Measurement of Enterovirus Uncoating
|
|
Author:
Date:
2020-04-05
[Abstract] Viruses need to open, i.e., uncoat, in order to release their genomes for efficient replication and translation. Especially for non-enveloped viruses, such as enteroviruses, the cues leading to uncoating are less well known. The status of the virus has previously been observed mainly by transmission electron microscopy using negative staining, cryo electron microscopy, X-ray crystallography or gradient separation (reviewed in Tuthill et al., 2010, Myllynen et al., 2016, Ruokolainen et al., 2019). However, monitoring of uncoating has been limited by the lack of methods detecting dynamic changes of the virions. Here, we present a real-time fluorescence based protocol, which detects the viral genome (RNA) during various stages of uncoating in vitro, ...
[摘要]
[摘要 ] 病毒需要打开，即，脱壳，以释放其基因组的有效复制和翻译。特别是对于诸如肠病毒之类的非包膜病毒，导致脱壳的线索鲜为人知。病毒的状态之前已经使用负染色主要见于通过透射电子显微镜，低温电子显微镜，X射线晶体学或梯度分离（在塔海尔综述等人。，2010，Myllynen 等人，2016年，Ruokolainen 等。，2019）。但是，监控您 由于缺乏检测病毒粒子动态变化的方法，涂层受到了限制。在这里，我们提出了一种实时基于荧光的协议，其中在脱壳的不同阶段检测到病毒基因组（RNA）在体外，而RNA仍然是颗粒内部的是已经实际RNA释放之前被扩展，并且当所述RNA具有从病毒颗粒中完全释放出来。我们的方法允许探索各种分子因素如何促进或抑制病毒的脱壳。
[背景 ] 在我们先前的研究中，我们发现感染性中间回声病毒1颗粒使RNA嵌入染料SYBR Green II进入病毒颗粒（Myllynen 等，2016）。可以观察到这是荧光的增加，并且记录的荧光不易被RNase消化（Myllynen 等，2016）。利用此信息，我们开发了一种实时方法，用于在荧光光谱中使用SYBR Green II染料和RNase监视病毒的打开。通过添加SYBR Green II和引发脱膜的因素，并观察SYBR Green ...
|
|
|
| Purification of RNA Mango Tagged Native RNA-protein Complexes from Cellular Extracts Using TO1-Desthiobiotin Fluorophore Ligand
|
|
Author:
Date:
2018-04-05
[Abstract] A native purification strategy using RNA Mango for RNA based purification of RNA-protein complexes is described. The RNA Mango aptamer is first genetically engineered into the RNA of interest. RNA Mango containing complexes obtained from cleared cellular native extracts are then immobilized onto TO1-Desthiobiotin saturated streptavidin agarose beads. The beads are washed to remove non-specific complexes and then the RNA Mango containing complexes are eluted by the addition of free biotin to the beads. Since the eluted complexes are native and fluorescent, a second purification step such as size exclusion chromatography can easily be added and the purified complexes tracked by monitoring fluorescence. The high purity native complexes resulting from this two-step purification strategy can ...
[摘要] 描述了使用RNA Mango进行RNA-蛋白质复合物的RNA纯化的天然纯化策略。 RNA芒果适体首先被基因工程改造成感兴趣的RNA。 然后将从清除的细胞天然提取物获得的含有RNA复合物的复合物固定在TO1-Desthiobiotin饱和的链霉亲和素琼脂糖珠上。 洗涤珠粒以去除非特异性复合物，然后通过向珠粒中加入游离生物素来洗脱含RNA芒果的复合物。 由于洗脱的复合物是天然的和荧光的，所以可以容易地添加第二纯化步骤如尺寸排阻色谱，并且通过监测荧光追踪纯化的复合物。 通过这种两步纯化策略产生的高纯度天然复合物可以用于进一步的生物化学表征。
【背景】目前的RNA标签受限于诸如差K ，大尺寸，潜在的生物学干扰或缺乏固有荧光的限制（Panchapakesan等人， 2015年）。 RNA芒果很小，可以简单地整合到茎环结构中，特别是GNRA tetraloops中，它具有生物耐受性，并且最重要的是对其噻唑橙基（TO1）配体TO1-Desthiobiotin（TO1-Dtb）具有高亲和力。 ...
|
|
|
| Capillary Electrophoresis in Hydroxyethylcellulose Solutions for the Analysis of dsDNA, dsRNA, and siRNA
|
|
Author:
Date:
2016-08-05
[Abstract] Capillary electrophoresis (CE) is identified as a promising technology for the study of nucleic acid molecules because of its high efficiency, high throughput with automation and integration. Compared to the traditional method of slab gel electrophoresis (SGE), the advantages of CE cannot be emphasized more. Most of CE process, including sample injection, detection and data analysis, is able to be automated which will save great labor for industrial and research labs. CE used the separation channel with micrometer-scale diameter, so the joule heat is easy to be dissipated during electrophoresis. Thus high separation voltage (> 100 V/cm) is allowed in CE while in SGE (usually ~10 V/cm) it usually causes severe band broadening. Because the band broadening is restrained efficiently in CE, ...
[摘要] 毛细管电泳（CE）被认为是研究核酸分子的有前景的技术，因为它具有高效率，具有自动化和整合的高通量。与传统的平板凝胶电泳（SGE）方法相比，CE的优点不再强调。大多数CE过程，包括样品注入，检测和数据分析，能够自动化，这将为工业和研究实验室节省大量的劳动力。 CE使用具有微米尺度直径的分离通道，因此在电泳期间焦耳热容易被消散。因此，在CE中允许高分离电压（> 100V/cm），而在SGE（通常〜10V/cm）下，其通常引起严重的带拓宽。因为在CE中能够有效地抑制谱带展宽，所以它能够检测微小的样品并且比SGE更敏感。允许高电压的优点因此加速了CE分离并且与SGE相比产生更好的通量。 CE成本较低的试剂，例如缓冲溶液，筛分基质，染料试剂等。此外，微米级通道容易与上游和下游样品处理单元集成，在芯片上形成实验室。 CE的这个优点已经吸引了来自各个领域的研究人员的相当大的兴趣。
CE的困难涉及将凝胶（琼脂糖或交联聚丙烯酰胺）填充到毛细管中。此外，凝胶毛细管的再现性和寿命受到限制。但是小直径毛细管允许使用可更换的聚合物溶液，其可以有效地防止分离缓冲液的对流。聚合物溶液更容易填充到毛细管中并产生更稳定的分离。因此，通过进行毛细管聚合物电泳（CPE）解决了这些困难，这将在本协议中描述。
已经开发了几种分离模式，例如毛细管凝胶电泳（CGE），CPE，毛细管区带电泳（CZE），毛细管等速电泳（CITP）等，用于分析不同种类的分子。在这里，我们详细介绍了CPE的协议，这是用于分离dsDNA，dsRNA（包括siRNA）分子。将聚合物溶液填充到毛细管中作为用于双链核酸分离的筛分基质。在这种情况下使用羟乙基纤维素（HEC）聚合物作为筛分聚合物。详细描述了自制CE系统。
...
|
|
|