| Multilayered Fabrication Assembly Technique to Engineer a Corneal Stromal Equivalent
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Author:
Date:
2021-03-20
[Abstract] Tissue engineering has emerged as a strategy to combat the donor shortage of human corneas for transplantation. Synthetic corneal substitutes are currently unable to support the normal phenotype of human cells and so decellularized animal corneas have been deployed to more closely provide the topographical and biochemical cues to promote cell attachment and function. Although full thickness decellularized corneas can support corneal cells, the cells are slow to populate the scaffold and density declines from the surface. To avoid these problems, this protocol describes the stacking of alternate layers of decellularized porcine corneal sheets and cell-laden collagen hydrogel to produce a corneal construct. The sheets are obtained by cryosectioning porcine corneas, decellularizing them with ...
[摘要] [摘要]组织工程学已成为一种解决人类角膜移植供体短缺的策略。合成的角膜替代物目前不能支持人类细胞的正常表型，因此已经使用脱细胞的动物角膜来更紧密地提供地形和生化线索以促进细胞附着和功能。尽管全厚度的脱细胞角膜可以支持角膜细胞，但这些细胞填充支架的速度很慢，并且密度从表面降低。为了避免这些问题，该协议描述了脱细胞层的交替层的堆叠 猪角膜片和载有细胞的胶原蛋白水凝胶可产生角膜构建体。通过将猪角膜冷冻切片，用去污剂和核酸酶使它们脱细胞，最后进行空气干燥以储存和易于制造，从而获得了薄片。然后将角膜基质细胞封装在I型胶原溶液中，并在这些薄片之间进行浇铸。该协议提出了一种快速的方法，以确保仅使用组织来源的材料即可在整个构建体中获得高细胞度。
图形摘要：
获得角膜基质等效物的主要过程概述
[背景]角膜失明影响着全球数百万人，治疗主要依赖于人类供体角膜的移植（Gain等人，2016）。由于这些捐赠是稀缺的，因此需要基于生物材料的组织工程学的替代方案。正在开发各种各样的策略和材料来工程化角膜组织，一种有前途的方法是使用脱细胞的动物角膜（Fernández- Pérez和Ahearne ...
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| Preparation of Sequencing RNA Libraries through Chemical Cross-linking Coupled to Affinity Purification (cCLAP) in Saccharomyces cerevisiae
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Author:
Date:
2018-10-05
[Abstract] Ribonucleoprotein particles (mRNPs) are complexes consisting of mRNAs and RNA-binding proteins (RBPs) which control mRNA transcription localization, turnover, and translation. Some mRNAs within the mRNPs have been shown to undergo degradation or storage. Those transcripts can lack general mRNA elements, like the poly(A) tail or 5’ cap structure, which prevent their identification through the application of widely-used approaches like oligo(dT) purification. Here, we describe a modified cross-linking affinity purification protocol (cCLAP) based on existing cross-linking and immunoprecipitation (CLIP) methods to isolate mRNAs which could be deadenylated, decapped and/or partially degraded in mRNPs, opening the possibility to detect different types of non-coding RNAs (ncRNAs). Once isolated, ...
[摘要] 核糖核蛋白颗粒（mRNP）是由mRNA和RNA结合蛋白（RBP）组成的复合物，其控制mRNA转录定位，转换和翻译。已显示mRNP内的一些mRNA经历降解或储存。那些转录物可能缺乏一般的mRNA元件，如poly（A）尾或5'帽结构，这通过应用广泛使用的方法如oligo（dT）纯化来阻止它们的鉴定。在这里，我们描述了基于现有的交联和免疫沉淀（CLIP）方法的修饰的交联亲和纯化方案（cCLAP），以分离mRNP中可被去腺苷酸化，去除和/或部分降解的mRNA，从而开启了检测不同的可能性。非编码RNA（ncRNA）的类型。分离后，将RNA进行衔接子连接，然后进行下一代测序（NGS）。由于快速有效的交联和淬灭步骤，该方案也适用于瞬时诱导的mRNP颗粒。实例包括由外在应激物触发的处理体（PB）或应力颗粒（SG）。其重现性和广泛应用使该方案成为研究特定RNP的RNA组成的有用且有力的工具。
【背景】mRNP内转录物的表征对于理解细胞转录和转录后过程至关重要。通过交联和免疫沉淀，然后通过RNA-Seq从mRNP颗粒中分离RNA已经成为鉴定mRNA靶标的常用方法（Tagwerker et al。，2006; Hafner et al。，2010; Kishore et al。，2011）。 ...
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| The RiboPuromycylation Method (RPM): an Immunofluorescence Technique to Map Translation Sites at the Sub-cellular Level
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Author:
Date:
2018-01-05
[Abstract] While isotopic labeling of amino acids remains the reference method in the field for quantifying translation rate, it does not provide any information on spatial localization of translation sites. The rationale behind developing the ribopuromycylation method (RPM) was primarily to map translation sites at the sub-cellular level while avoiding detection of newly synthesized proteins released from ribosomes. RPM visualizes actively translating ribosomes in cells via standard immunofluorescence microscopy in fixed and permeabilized cells using a puromycin-specific monoclonal antibody to detect puromycylated nascent chains trapped on ribosomes treated with a chain elongation inhibitor.
[摘要] 尽管氨基酸的同位素标记仍然是用于定量翻译速率的领域中的参考方法，但是其不提供关于翻译位点的空间定位的任何信息。 开发ribopuromycylation方法（RPM）的基本原理主要是在亚细胞水平上绘制翻译位点，同时避免检测从核糖体释放的新合成的蛋白质。 RPM通过使用嘌呤霉素特异性单克隆抗体的固定的和透化的细胞中的标准免疫荧光显微镜可视化主动翻译细胞中的核糖体以检测捕获在用链延长抑制剂处理的核糖体上的嘌呤化新生链。
【背景】几十年来，氨基酸的同位素标记被认为是研究蛋白质翻译的金标准。虽然这种方法已被证明是非常准确的评估翻译率，它没有提供翻译核糖体的位置信息。最近，氨基酸类似物使荧光检测新生链（Dieterich等人，2007）。然而，几乎所有检测到的信号都来自核糖体释放的多肽。我们最初的想法是开发一种方法来标记新生链，同时还束缚于翻译核糖体。
嘌呤霉素（PMY）是一种氨基糖苷类抗生素，模拟带电荷的tRNA Tyr并掺入核糖体A位点。因此，PMY通过核糖体催化 - ...
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