| Determination of Polyhydroxybutyrate (PHB) Content in Ralstonia eutropha Using Gas Chromatography and Nile Red Staining
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Author:
Date:
2018-03-05
[Abstract] Ralstonia eutropha H16 produces and mobilizes (re-utilizes) intracellular polyhydroxybutyrate (PHB) granules during growth. This protocol describes the visualization of intracellular Nile red stained PHB granules and the quantification of PHB by gas chromatography. Our first method describes how to analyze PHB granules by fluorescence microscopy qualitatively. Our second approach enables the conversion of PHB to volatile hydroxycarboxylic acid methyl esters by acidic methanolysis and their quantification by gas chromatography. Through this method, it is possible to obtain an absolute quantification of PHB, e.g., per cell dry weight.
[摘要] 在生长过程中，富养罗尔斯通氏菌H16产生和动员（重新利用）细胞内聚羟基丁酸酯（PHB）颗粒。 该协议描述了细胞内尼罗红染色的PHB颗粒的可视化和通过气相色谱定量PHB。 我们的第一种方法描述了如何通过荧光显微镜定性分析PHB颗粒。 我们的第二种方法可以通过酸性甲醇分解和气相色谱定量法将PHB转化为挥发性羟基羧酸甲酯。 通过该方法，可以获得PHB的绝对定量，例如，每细胞干重。
【背景】聚羟基脂肪酸酯（PHA），尤其是聚羟基丁酸酯（PHB），是许多原核生物物种中的能量和碳储存化合物，确保细菌在压力条件下存活（Anderson和Dawes，1990;Pötter和Steinbüchel，2006; Jendrossek和Pfeiffer，2014; Bresan， >等。，2016）。这些生物聚合物的工业应用是生物降解塑料的生产（Chen，2009; Riedel等人，2015）和潜在药物成分的研究（Wu，2009; Zonari等人， ，2015; Pacheco et al。，2015; Giretova ...
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| Infection of Soybean Plants with the Insect Bacterial Symbiont Burkholderia gladioli and Evaluation of Plant Fitness
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Author:
Date:
2017-12-20
[Abstract] To investigate the establishment and consequences of host-microbe interactions, it is important to develop controlled infection assays suitable for each system, as well as appropriate methods to evaluate successful infection and its associated effects. Here, we describe a procedure for bacterial inoculation of soybean plants, followed by the assessment of systemic infection and impact on plant fitness. Soybean (Glycine max) seedlings were mechanically wounded using a device that mimics insect herbivory and inoculated with known cell numbers of Burkholderia gladioli bacteria previously isolated from an insect host. The impact on the plants was evaluated by monitoring changes in height, time to flowering and chlorophyll content during plant development, and by quantifying ...
[摘要] 为了研究宿主 - 微生物相互作用的建立和后果，开发适用于每个系统的受控感染测定法以及评估成功感染及其相关作用的适当方法是重要的。在这里，我们描述了大豆植物的细菌接种程序，然后评估全身感染和对植物健康的影响。使用模拟昆虫食草动物的装置对大豆（Glycine max）幼苗进行机械性伤害，并用先前从昆虫宿主分离的已知细胞数目的伯克霍尔德氏菌（B.coli）进行接种。通过监测植物发育过程中身高，开花时间和叶绿素含量的变化以及通过与用无菌水接种的植物相比量化种子产量来评估对植物的影响。使用定量PCR和荧光原位杂交（FISH）在来自发育植物的组织中检查细菌感染的存在和增殖。
微生物与不同的真核生物建立共生关系，对宿主的适应性有着深远的影响，从有益到不利（Frank，1997）。在许多情况下，这些协会是直接或间接的影响与其他生物，如潜在的替代主机相互作用。举例来说，植物，微生物和昆虫之间有许多三方相互作用，其中微生物共生体在不同宿主之间传播并影响相关生物体的生理或生态（Frago等人）。 ，2012; Gilbert et al。，2012）。在植物性的Lagriinae甲虫中，与来自植物致病性分支的细菌（Burkholderia gladioli）建立了共生伙伴关系，表明这种关联在三方相互作用的情况下发展。先前已经证明了从 Lagria villosa ...
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| Generation of Targeted Knockout Mutants in Arabidopsis thaliana Using CRISPR/Cas9
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Author:
Date:
2017-07-05
[Abstract] The CRISPR/Cas9 system has emerged as a powerful tool for gene editing in plants and beyond. We have developed a plant vector system for targeted Cas9-dependent mutagenesis of genes in up to two different target sites in Arabidopsis thaliana. This protocol describes a simple 1-week cloning procedure for a single T-DNA vector containing the genes for Cas9 and sgRNAs, as well as the detection of induced mutations in planta. The procedure can likely be adapted for other transformable plant species.
[摘要] CRISPR / Cas9系统已成为植物及其以外基因编辑的强大工具。 我们已经开发了植物载体系统，用于拟南芥中多达两个不同靶位点的基因的目标Cas9依赖性诱变。 该方案描述了对于含有Cas9和sgRNA的基因的单个T-DNA载体的简单的1周克隆程序，以及植物中诱导突变的检测。 该方法可能适用于其他可转化植物物种。
【背景】CRISPR / Cas9系统（Cas9）提供了一种简单且广泛适用的方法来修改感兴趣的基因组区域，因此成为植物和其他生物体基因组编辑的首选工具（Schiml和Puchta，2016）。该系统依赖于可以通过短的人造单指导RNA分子（sgRNA）向基因组DNA序列引导的化脓性链球菌（Cas9）的细菌Cas9核酸酶（Jinek等人， ，2012），在那里它创建一个双链断裂（DSB）。然后通过植物细胞的固有DNA修复机制修复这些DSB。在这里，可以区分两个主要途径（Salomon和Puchta，1998）。 （i）与DSB位点高度同源的DNA分子可用作修复模板。可以利用这种同源性定向修复（HDR）方法在DSB的现场引入特定的序列（Schiml等人，2014; Baltes and Voytas，2015）。然而，由于这些序列的低融合率，植物中HDR介导的基因编辑仍然具有挑战性。 ...
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