| Secretion of Adipsin as an Assay to Measure Flux from the Endoplasmic Reticulum (ER)
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Author:
Date:
2017-04-05
[Abstract] In this protocol we describe a quantitative biochemical assay to assess the efficiency of endoplasmic reticulum (ER) to Golgi protein transport in adipocytes (Bruno et al., 2016). The assay takes advantage of the fact that adipocytes secrete various bioactive proteins, known as adipokines. As a measure of ER to Golgi flux we determine the rate of bulk secretion of the adipokine adipsin post washout of Brefeldin A (BFA) treatment using immunoblotting. Because BFA treatment results in an accumulation of adipsin in the ER, the exit of adipsin from the ER upon BFA washout is synchronized across cells and experimental conditions. Thus, using this simple assay one can robustly determine if perturbations, such as knocking down a protein, have an effect on ER to Golgi protein transport.
[摘要] 在该方案中，我们描述了一种定量生化测定法来评估内质网（ER）对脂肪细胞中高尔基体蛋白质转运的效率（Bruno等，2016）。 该测定法利用脂肪细胞分泌各种生物活性蛋白质（称为脂肪因子）的事实。 作为对高尔基体通量的ER的测量，我们使用免疫印迹法确定了使用Brefeldin A（BFA）处理的脂肪因子adipsin后消失的体积分泌速率。 因为BFA治疗导致ER中Adipsin的积累，所以在BFA洗脱时，Adipsin从ER的出口在细胞和实验条件下同步。 因此，使用这种简单的测定法可以稳健地确定扰动，如敲低蛋白质，是否对高尔基蛋白转运的ER有影响。
【背景】新合成的蛋白质通过分泌途径从细胞分泌到细胞膜（PM）中。分泌路线包括从ER到高尔基体的运输，穿过高尔基体堆叠，以及从高尔基网络（TGN）到PM的运动。这些运输步骤中的每一个提供用于调节分泌物的节点。虽然大多数细胞能够分泌蛋白质，但某些特定的细胞类型是特异性蛋白质的专业秘密。脂肪细胞，例如，分泌激素，称为脂肪因子，影响各种器官的能量代谢。为了更好地了解脂肪因子分泌的分子基础，我们开发了一种测定方法，研究了从ER到脂肪细胞的高尔基体的脂肪因子，一种脂肪因子的转运。研究ER到高尔基体运输的传统和常用的方法是监测从ER融合到GFP（VSVG-GFP）的温度敏感性水泡性口炎病毒G蛋白ts045的出口（Presley等，1997）。使用adipsin分泌测定法研究脂肪细胞中的高铁运输的优点是监测来自ER的内源性蛋白质的通量，而不是异位表达的报道蛋白。 ...
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| Cell Surface Protein Detection to Assess Receptor Internalization
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Author:
Date:
2016-10-20
[Abstract] The migration of membrane receptors upon exposure to different stimulants/inhibitors is of great importance. Among others, the internalization of membrane receptors affects their accessibility to ligands and cell responsiveness to environmental cues. Experimentally, receptor internalization can be used as a measure of their activation. In our studies, we employed this approach to explore cross-talk between a seven transmembrane domain receptor for neuropeptide Y (NPY), Y5R, and a tyrosine kinase receptor for brain-derived neurotrophic factor (BDNF), TrkB. To this end, we measured the internalization of Y5R upon stimulation with the TrkB ligand, BDNF. Upon treatment with BDNF, the cells were exposed to a membrane impermeable, biotinylation reagent that selectively labels surface proteins. ...
[摘要] 膜受体在暴露于不同的刺激剂/抑制剂时的迁移是非常重要的。其中，膜受体的内化影响其对配体的可及性和对环境线索的细胞应答性。在实验上，受体内化可用作其活化的量度。在我们的研究中，我们采用这种方法来探讨神经肽Y（NPY）的七个跨膜结构域受体，Y5R和脑源性神经营养因子（BDNF），TrkB的酪氨酸激酶受体之间的串扰。为此，我们测量了用TrkB配体BDNF刺激后Y5R的内化。在用BDNF处理后，将细胞暴露于选择性标记表面蛋白的不透膜的生物素化试剂。随后，生物素化的膜蛋白在具有抗生物素蛋白树脂的柱上亲和纯化，并通过蛋白质印迹分析。存在于对照和配体处理的细胞的细胞表面上的受体部分的差异用作其内化和对特定刺激的反应的量度。
[Backg 回合] 可以使用两种主要策略 - 显微镜和生物化学来测量响应外部刺激的细胞膜受体内化。最常见的方法是使用显微镜 - ...
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