| Isolation, Purification and Characterization of Exosomes from Fibroblast Cultures of Skeletal Muscle
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Author:
Date:
2020-04-05
[Abstract] Exosomes are dynamic nanovesicles secreted by virtually all cells and are present in all biological fluids. Given their highly heterogeneous content exosomes have been implicated in many physiological and pathological processes that they exert by influencing cell-cell and cell-ECM communication. In recent years an increasing number of methods have been established for the purification and characterization of exosomes. These include ultracentrifugation, ultrafiltration, size exclusion chromatography, immune capture and precipitation using a proprietary polymer. Here, we provide a protocol based on differential ultracentrifugation and sucrose density gradients tailored for the isolation of crude and ultra-pure exosomes from primary fibroblast cultures derived from adult mouse skeletal ...
[摘要] [摘要 ] 外来体是几乎所有细胞分泌的动态纳米囊泡，并存在于所有生物体液中。鉴于它们的异质含量很高，外泌体已牵涉到它们通过影响细胞-细胞和细胞-ECM通讯而发挥的许多生理和病理过程。近年来，已经建立了越来越多的方法外泌体的纯化和表征。其中包括超速离心，超滤，尺寸排阻色谱，免疫捕获和使用专有聚合物的沉淀。在这里，我们提供了基于差分超速离心和蔗糖密度梯度的协议，该协议专门用于从成年小鼠骨骼肌衍生的原代成纤维细胞培养物中分离粗制和超纯外泌体。可以对该协议进行修改和修改，以从各种组织和体液中分离和表征外泌体。
背景 ] ë xosomes是单膜，异质纳米囊泡直径范围从30至150nm，secre 由所有细胞和存在于几乎所有的体液泰德。外泌体中存在的可溶性和膜大分子，mRNA，microRNA的光谱取决于代谢状态以及分泌这些纳米囊泡的细胞的发育起源。由于它们的货物组成，外泌体可以启动接收细胞中的信号传导途径，并参与了发育，免疫和正常组织生理的维持。在神经退行性疾病，纤维化和癌症等疾病条件下，它们被证明可以触发和传播病理刺激（Rackov 等，2018; Gurunathan 等，2019; van de Vlekkert 等，2019）。在这里，我们描述了从成年小鼠腓肠肌（GA）肌肉建立的成纤维细胞培养物中纯化外泌体的方案（van de Vlekkert ...
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| Murine Bronchoalveolar Lavage
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Author:
Date:
2017-05-20
[Abstract] A basic Bronchoalveolar lavage (BAL) procedure in mouse is described here. Cells and fluids obtained from BAL can be analyzed by Hema3-staining, immunostaining, Fluorescence-activated cell sorting (FACS), PCR, bicinchoninic acid protein assay, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), luminex assays, etc., to examine the immune cells, pathogens, proteins such as cytokines/chemokines, and the expression levels of inflammation-related and other genes in the cells. This will help to understand the underlying mechanisms of these lung diseases and develop specific and effective drugs.
[摘要] 这里描述了小鼠中基本的支气管肺泡灌洗（BAL）程序。可以通过Hema3染色，免疫染色，荧光激活细胞分选（FACS），PCR，二金鸡宁酸蛋白测定，酶联免疫吸附测定（ELISA），luminex检测等来分析从BAL获得的细胞和液体。 / em>，以检查免疫细胞，病原体，蛋白质如细胞因子/趋化因子，以及细胞中炎症相关基因和其他基因的表达水平。这将有助于了解这些肺部疾病的潜在机制，并开发具体有效的药物。
背景 支气管肺泡灌洗（BAL）是通常用于诊断肺部疾病（包括肺癌）的简单且典型的方法（Daubeuf和Frossard，2012）。它用于采样肺组分，以确定肺中的蛋白质组成，免疫细胞和病原体。肺部慢性炎症在肺癌起始和进展中起关键作用。为了阐明肺肿瘤发生的炎症的潜在机制，我们的实验室使用了一种基本的BAL方案来确定肺部免疫反应（Qu等人，2015; Zhou等）。 ，2015; Sun等人，2016; Zhou等人，2017）。
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| Isolation of Murine Alveolar Type II Epithelial Cells
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Date:
2017-05-20
[Abstract] We have optimized a protocol for isolation of alveolar type II epithelial cells from mouse lung. Lung cell suspensions are prepared by intratracheal instillation of dispase and agarose followed by mechanical disaggregation of the lungs. Alveolar type II epithelial cells are purified from these lung cell suspensions through magnetic-based negative selection using a Biotin-antibody, Streptavidin-MicroBeads system. The purified alveolar type II epithelial cells can be cultured and maintained on fibronectin-coated plates in DMEM with 10% FBS. This protocol enables specific investigation of alveolar type II epithelial cells at molecular and cellular levels and provides an important tool to investigate in vitro the mechanisms underlying lung pathogenesis.
[摘要] 我们优化了从小鼠肺分离肺泡II型上皮细胞的方案。通过气管内滴注分泌酶和琼脂糖，然后机械解聚肺来制备肺细胞悬浮液。通过使用生物素抗体Streptavidin-MicroBeads系统的磁性阴性选择，从这些肺细胞悬液中纯化肺泡II型上皮细胞。可以将纯化的肺泡II型上皮细胞培养并维持在含有10％FBS的DMEM中的纤连蛋白包被的平板上。该方案能够在分子和细胞水平上对肺泡II型上皮细胞进行特异性研究，并提供了一种重要的工具，用于在体外研究肺发病机制的机制。
背景 肺泡II型上皮细胞在肺泡完整性维持，表面活性蛋白合成和分泌中起关键作用，并防止细菌和病毒的肺部感染。最近使用小鼠肺癌模型的研究已经证明，肺泡II型上皮细胞是由化学致癌物质和致癌突变诱导的腺瘤/腺癌的关键细胞（Qu 等人，2015; Zhou > et al。，2015和2017）。为了进一步扩大我们对肺泡II型上皮细胞在体内肺发病机制中的作用的理解，需要分离肺泡II型上皮细胞以允许体外精确的机理分析， EM>。基于先前的研究（Corti等人，1996; Rice等人，2002），在我们的实验室中使用了一种修饰的方法来分离高度纯化的，可行的和可培养的来自小鼠的肺泡II型上皮细胞（Zhou等人，2015; Sun等人，2016）。
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