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Date:
2017-07-05
[Abstract] Cdk5 activity is regulated by the amounts of two activator proteins, p35 and p39 (Tsai et al., 1994; Zheng et al., 1998; Humbert et al., 2000). The p35-Cdk5 and p39-Cdk5 complexes have differing sensitivity to salt and detergent concentrations (Hisanaga and Saito, 2003; Sato et al., 2007; Yamada et al., 2007; Asada et al., 2008). Cdk5 activation can be directly measured by immunoprecipitation of Cdk5 with its bound activator, followed by a Cdk5 kinase assay. In this protocol, buffers for cell lysis and immunoprecipitation are intended to preserve both p35- and p39-Cdk5 complexes to assess total Cdk5 activity. Cells are lysed and protein concentration is determined in the post-nuclear supernatant. Cdk5 is immunoprecipitated from equal ...
[摘要] Cdk5活性受两种激活蛋白p35和p39（Tsai et al。，1994; Zheng et al。，1998; Humbert等人）的量的调节，2000）。 p35-Cdk5和p39-Cdk5复合物对盐和洗涤剂浓度的敏感性不同（Hisanaga和Saito，2003; Sato et al。，2007; Yamada等人， 2007; Asada 等人，2008）。 Cdk5激活可以通过Cdk5与其结合的激活剂的免疫沉淀直接测量，随后进行Cdk5激酶测定。在该方案中，用于细胞裂解和免疫沉淀的缓冲液旨在保持p35-和p39-Cdk5复合物以评估总Cdk5活性。裂解细胞，并在核后上清液中测定蛋白浓度。 Cdk5在实验组之间从等量的总蛋白免疫沉淀。然后进行洗涤以除去外来蛋白质并平衡激酶缓冲液中的Cdk5-活化剂复合物。然后将Cdk5与组蛋白H1孵育，组蛋白H1是Cdk5和[γ- 32 P] ATP在体外成功建立的靶标。反应通过SDS-PAGE解析并转移到膜上，用于可视化H1磷酸化和免疫沉淀的Cdk5水平的免疫印迹。我们已经使用该测定来建立p39作为少突神经胶质谱系中Cdk5的主要活化剂。然而，该测定法适用于对裂解条件进行适当调整的其它细胞谱系或组织。
【背景】虽然Cdk5通常与神经元功能相关，但最近的工作已经证明Cdk5也可以调节少突胶质细胞祖细胞（OPC）的发育（Tang等人，1998; ...
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Date:
2016-10-05
[Abstract] This protocol describes the in vitro phosphorylation of ubiquitin and Parkin by the kinase PINK1 using recombinant proteins. Both substrates, ubiquitin and Parkin, are phosphorylated at the conserved serine 65 residue (pS65-ubiquitin and pS65-Parkin). The protocol also includes the use of monomeric and K48- and K63-linked poly-ubiquitin chains as alternative substrates. Although there are commercially available antibodies, we have not tested their performance in this assay since, but used validated antibodies from our laboratory. An alternative antibody-independent method, the use of phos-tag gels to detect pS65-ubiquitin and pS65-Parkin, is described in addition.
[摘要] 该协议描述了通过激酶PINK1使用重组蛋白的泛素和帕金蛋白的体外磷酸化。两种底物，泛素和帕金蛋白，在保守的丝氨酸65残基（pS65-泛素和pS65-帕金蛋白）上磷酸化。该方案还包括使用单体和K48和K63连接的聚泛素链作为替代底物。虽然有市售的抗体，我们没有测试他们在这个测定中的性能，因为，但使用我们实验室的验证抗体。另外描述了另一种抗体非依赖性方法，使用phos-标记凝胶检测pS65-泛素和pS65-帕金。
[背景] 在细胞中， PINK1是稳定和激活的线粒体膜去极化和其他形式的应力，导致线粒体损伤。活化的PINK1磷酸化泛素，其作为线粒体表面上胞质E3泛素连接酶Parkin的受体。 Parkin对PINK1的磷酸化是Parkin对线粒体底物的完全活性所必需的。活性pS65-Parkin的存在在前馈机制中扩增了作为线粒体标记的线粒体上的pS65-泛素的量。最终，受损的线粒体被自噬噬菌体衔接子识别，并将被蛋白酶体和自噬（mitophagy）降解。这种关键的线粒体质量控制通路促进线粒体的周转，并防止可导致细胞变性的功能障碍线粒体的积累。 PINK1或Parkin中的功能缺失突变与早发性帕金森病相关。
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