| Determination of Adeno-associated Virus Rep DNA Binding Using Fluorescence Anisotropy
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Author:
Date:
2017-03-20
[Abstract] Quantitative measurement of proteins binding to DNA is a requisite to fully characterize the structural determinants of complex formation necessary to understand the DNA transactions that regulate cellular processes. Here we describe a detailed protocol to measure binding affinity of the adeno-associated virus (AAV) Rep68 protein for the integration site AAVS1 using fluorescent anisotropy. This protocol can be used to measure the binding constants of any DNA binding protein provided the substrate DNA is fluorescently labeled.
[摘要] 与DNA结合的蛋白质的定量测量是完全表征理解调节细胞过程的DNA交易所必需的复合物形成结构决定簇的必要条件。在这里，我们描述了使用荧光各向异性来测量腺相关病毒（AAV）Rep68蛋白与整合位点AAVS1的结合亲和力的详细方案。如果底物DNA被荧光标记，则该方案可用于测量任何DNA结合蛋白的结合常数。
背景 荧光偏振各向异性已经成为测量蛋白质与大分子，核酸，肽和其他蛋白质等多种配体相互作用的最流行方法之一。该方法快速，便宜，可以修改为配备荧光检测器的读卡器。该技术基于以下原理：当荧光分子被平面偏振光激发时，如果分子是静止的或者如果其旋转缓慢，发射的光在同一平面内保持极化。相反，如果分子快速旋转（由于体积小），则光在不同的平面中发射。这些变化可以通过平行和垂直强度的归一化差异量化。极化被定义为P =（I⊥⊥⊥⊥⊥⊥⊥⊥⊥⊥⊥⊥⊥⊥⊥⊥⊥⊥⊥⊥⊥⊥⊥⊥⊥⊥⊥⊥⊥⊥⊥⊥⊥⊥⊥⊥）其中I = 是平行强度，I⊥是垂直强度。一种替代方式是定义各向异性，A =（I⊥⊥⊥⊥⊥⊥⊥⊥⊥< ub="">）。两个参数可以互换使用来描述极化的变化。因此，当小荧光DNA分子结合蛋白质时，较大的复合物将比DNA分子旋转得更慢，改变偏振光的平面并提高各向异性值。我们已经使用这种技术来测量AAV ...
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| Purification and Identification of Novel Host-derived Factors for Influenza Virus Replication from Human Nuclear Extracts
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Author:
Date:
2016-09-20
[Abstract] Recently, we identified two host cell-derived proteins as novel stimulatory factors of influenza virus RNA replication process, termed “Influenza virus REplication Factor-2 (IREF-2)”, from human nuclear extracts (NEs) by employing biochemical complementation assays (Sugiyama et al., 2015). Herein, we describe detailed methods for successive procedures for identification and purification of IREF-2, including large-scale suspension culture of HeLa S3 cells, preparation of NEs and separation of IREF-2 by sequential column chromatography steps. This protocol can be modified and used for purification and identification of the other unknown nuclear protein(s) of your interest.
[摘要] 最近，我们通过使用生物化学互补试验（Sugiyama），从人类核提取物（NE）鉴定了两种宿主细胞衍生蛋白作为流感病毒RNA复制过程的新型刺激因子，称为“流感病毒复制因子-2（IREF-2）” et al。，2015）。 本文描述了用于IREF-2鉴定和纯化的连续方法的详细方法，包括HeLa S3细胞的大规模悬浮培养，NE的制备和顺序柱色谱步骤分离IREF-2。 该方案可以修改并用于纯化和鉴定您感兴趣的其他未知核蛋白。
【背景】甲型流感病毒基因组由8个分段和单链RNA（vRNA）组成。其转录和复制由病毒编码的RNA依赖性RNA聚合酶（RdRP）催化。几条证据表明某些宿主衍生因子调节病毒RNA合成（Nagata et al。，2008）。最近，通过相互作用分析和基因组RNAi筛选研究，已经报道了各种宿主衍生的蛋白质作为与病毒RNA合成相关的调节因子候选物。然而，其中包括间接涉及病毒RNA合成的一些假阳性相互作用因子和因子。相反，为了鉴定在病毒RNA合成过程中发挥直接作用的可靠和重要的宿主因子，我们使用了生物化学互补测定系统。在该系统中，在感染的细胞核中有效发生的病毒vRNA复制反应被解剖并在体外使用病毒RNA复制所必需的病毒因子重构，例如衍生自洗涤剂溶解的病毒颗粒的病毒RdRP和模型病毒基因组RNA模板和未感染的核提取物（NE）。
最近，我们已经报道，在体外用病毒因子和NE的粗制部分再现有效的vRNA复制（Sugiyama等，2015）。 ...
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