| Protocol for the Isolation and Super-resolution dSTORM Imaging of RyR2 in Cardiac Myocytes
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Author:
Date:
2018-08-05
[Abstract] Since its inception, super-resolution microscopy has played an increasingly important role in the discovery and characterization of nanoscale biological structure. dSTORM, which is one of the most commonly applied methods, relies on stochastic photoswitching of fluorophores to recreate a super-resolution image. The cardiac field has particularly benefitted from the application of this technique, as it has enabled sub-diffraction-limit visualization of calcium release units (CRUs) and the fundamental structures that trigger contraction. Acquisition of such images requires careful, reproducible sample preparation, and consistent imaging conditions maintained for the duration of the experiment. Here we present standardized methods for the production of dSTORM images of the Ca2+ ...
[摘要] 自成立以来，超分辨率显微镜在纳米级生物结构的发现和表征中发挥着越来越重要的作用。 dSTORM是最常用的方法之一，它依赖于荧光团的随机光切换来重建超分辨率图像。心脏场特别受益于该技术的应用，因为它已经实现了钙释放单元（CRU）的子衍射极限可视化和触发收缩的基本结构。获取这些图像需要仔细，可重复的样品制备，并且在实验期间保持一致的成像条件。在这里，我们提出了生产心肌细胞中Ca 2 + 释放通道Ryanodine Receptor type-2（RyR2）的dSTORM图像的标准化方法。所提出的方案特别关注涉及原发性心肌细胞分离，样品制备和成像的步骤，其中提供了针对实验溶液和显微镜设置的细节。本讨论之后是各种分析技术的概述，以识别集群和CRU中的RyR2组织
【背景】近年来，超分辨率显微镜的普及率迅速提高。已经描述了各种超分辨率技术，其使光学分辨率远低于光的衍射极限，在某些情况下接近可通过电子显微镜获得的光学分辨率。总之，这些技术的出现导致了纳米级生物结构，结构域和蛋白质相互作用的新研究的爆炸式增长。一种流行的超分辨率技术是直接随机光学显微镜（dSTORM），与标准共聚焦显微镜相比，它将相对简单的样品处理的优势与分辨率提高了约10倍（van de Linde ...
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| Embryonic Intravitreous Injection in Mouse
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Author:
Date:
2018-07-20
[Abstract] Axons of retinal ganglion cells (RGCs) relay visual information from the retina to lateral geniculate nucleus (LGN) and superior colliculus (SC), which are two major image-forming visual nuclei. Wiring of these retinal projections completes before vision begins. However, there are few studies on retinal axons at embryonic stage due to technical difficulty. We developed a method of embryonic intravitreous injection of dyes in mice to visualize retinal projections to LGN and SC. This study opens up the possibility of understanding early visual circuit wiring in mice embryos.
[摘要] 视网膜神经节细胞（RGC）的轴突将视觉信息从视网膜传递到外侧膝状核（LGN）和上丘（SC），这是两个主要的成像视觉核。 在视力开始之前完成这些视网膜投射的布线。 然而，由于技术困难，很少有关于胚胎期视网膜轴突的研究。 我们开发了一种胚胎玻璃体内注射染料的方法，用于观察LGN和SC的视网膜投射。 这项研究开辟了理解小鼠胚胎早期视觉电路布线的可能性。
【背景】早在胚胎第14.5天（E14.5）小鼠中，视网膜轴突开始向LGN和SC投射。 为了研究胚胎中的轴突投射，需要在注射手术前保持胚胎存活至少10小时，玻璃内注射染料。 以前的研究表明，胚胎可以使用含氧小鼠血清进行体外培养。 然而，营养多样性，氧饱和度和温度调节等问题会影响胚胎的生理状况。 在我们的研究中，我们通过胚胎中的子宫壁和眼睑进行玻璃体内注射，并在注射后将它们保存在子宫中。 从E15.5到E18.5很好地标记了对LGN和SC的视网膜轴突投射。
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| Preserve Cultured Cell Cytonemes through a Modified Electron Microscopy Fixation
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Author:
Date:
2018-07-05
[Abstract] Immunocytochemistry of cultured cells is a common and effective technique for determining compositions and localizations of proteins within cellular structures. However, traditional cultured cell fixation and staining protocols are not effective in preserving cultured cell cytonemes, long specialized filopodia that are dedicated to morphogen transport. As a result, limited mechanistic interrogation has been performed to assess their regulation. We developed a fixation protocol for cultured cells that preserves cytonemes, which allows for immunofluorescent analysis of endogenous and over-expressed proteins localizing to the delicate cellular structures.
[摘要] 培养细胞的免疫细胞化学是用于确定细胞结构内蛋白质的组成和定位的常用且有效的技术。 然而，传统的培养细胞固定和染色方案不能有效地保存培养的细胞色素，长期专门用于形态发生转运的丝状伪足。 结果，进行了有限的机械审讯以评估其监管。 我们开发了一种用于培养细胞的固定方案，该方案保留了细胞质，允许对内源性和过表达的蛋白质进行免疫荧光分析，这些蛋白质定位于脆弱的细胞结构。
【背景】Cytonemes被分类为薄的（~200nm直径）基于肌动蛋白的丝状伪足，长度超过2μm，可以转运形态发生素（Ramírez-Weber和Kornberg，1999）。这些信号结构首先在发育中的 Drosophila 翼成像盘中进行了详细分类和描述，随后在小鼠，小鸡和斑马鱼模型生物中进行了观察（Ramírez-Weber和Kornberg，1999; Sanders et al。，2013; Stanganello et al。，2015）。在大多数情况下，只有对过表达的荧光标记蛋白进行实时成像才能进行细胞色素检测。由于传统的固定方案未能保存这些脆弱的细丝，因此对培养细胞的细胞色素的检查受到限制。这些并发症一直是决定在发育和组织稳态期间驱动细胞色素形成和功能的细胞机制以及确定这些过程是否在疾病中被破坏的限制因素。
为了克服这些限制，我们开发了一种基于修饰电子显微镜固定剂（MEM-fix）的方案，该方案可以保留培养细胞的细胞质。 ...
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