| Expression and Purification of the Human Cation-chloride Cotransporter KCC1 from HEK293F Cells for Structural Studies
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Author:
Date:
2021-04-05
[Abstract] Cation-chloride cotransporters (CCCs) mediate the coupled, electroneutral symport of cations such as Na+ and/or K+ with chloride across membrane. Among CCCs family, K-Cl cotransporters (KCC1-KCC4) extrude intracellular Cl- by the transmembrane K+ gradient. In humans, these KCCs play vital roles in the physiology of the nervous system and kidney. However, mechanisms underlying the KCCs specific properties remain poorly understood, partly because purification of membrane proteins is challenging. Here, we present the protocol for purifying the full-length KCC1 from HEK293F cells used in our recent publication (Liu et al., 2019). The procedure may be adapted for functional and structural studies.
[摘要] [摘要]阳离子-氯化物共转运蛋白（CCC）介导诸如Na +和/或K +的阳离子与氯离子在膜上的耦合，电中性共价。间幼儿中心家庭，K-CL协同转运蛋白（KCC1-KCC4）抽UDE细胞内氯-通过跨膜ķ +梯度。在人类中，这些KCC在神经系统和肾脏的生理中起着至关重要的作用。然而，特定的KCC性质保持基本机制知之甚少，部分是因为膜蛋白的纯化是具有挑战性的。在这里，我们介绍了从我们最近的出版物中使用的HEK293F细胞中纯化全长KCC1的方案（Liu等人，2019）。该程序可适用于功能和结构研究。
[背景]人类溶质载体12（SLC12 ）基因家族编码阳离子的氯化物协同转运蛋白（CCCS）介导Cl组成的电中性同向转运-和阳离子的Na +或（和）K +跨越质膜。根据其转运特性和氨基酸序列定义，CCC可分为几个分支，包括两个Na-K-2Cl协同转运蛋白（NKCC1和NKCC2），一个Na-Cl协同转运蛋白（NCC）和四个K-Cl协同转运蛋白（KCC1-KCC4 ）。CCC在细胞体积调节，肾脏盐分重吸收和神经元GABA能调节中起重要作用。CCC的结构，生化和生物物理研究涉及在去污剂溶解状态下蛋白质生产和稳定方面的挑战。杆状病毒转导HEK293F细胞（BacMam）系统是异源表达由Eric ...
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| In vitro Analysis of Ubiquitin-like Protein Modification in Archaea
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Author:
Date:
2018-05-20
[Abstract] The ubiquitin-like (Ubl) protein is widely distributed in Archaea and involved in many cellular pathways. A well-established method to reconstitute archaeal Ubl protein conjugation in vitro is important to better understand the process of archaeal Ubl protein modification. This protocol describes the in vitro reconstitution of Ubl protein modification and following analysis of this modification in Haloferax volcanii, a halophilic archaeon serving as the model organism.
[摘要] 泛素样（Ubl）蛋白广泛分布于古细菌中并参与许多细胞途径。 为了更好地理解古细菌Ub1蛋白质修饰的过程，重建体外古细菌Ubl蛋白质缀合物的完善方法是很重要的。 该协议描述了Ubl蛋白质修饰的体外重建以及在作为模型生物的嗜盐古细菌Haloferax volcanii 中对这种修饰进行分析。
【背景】泛素（Ub）与靶蛋白共价连接的过程被称为泛素化，其控制真核细胞中大量的细胞过程（Glickman和Ciechanover，2002; Komander和Rape，2012）。遍在蛋白化由一系列酶（包括Ub激活酶（E1），Ub结合酶（E2s）和Ub连接酶（E3s））催化。泛素化的体外重建是确定酶之间或E3与蛋白质底物之间特异性的有用测定法（Zhao等人，2012）。在古细菌中，Ubl蛋白SAMP采用Ub折叠，并且与E1样酶UbaA催化的蛋白靶标异肽连接[Maupin-Furlow，（2014）综述]。尽管E1同系物在古细菌中广泛存在，但基于一级序列比较，在大多数古细菌中未预测经典E2或E3酶。我们最近对Haloferax volcanii的研究表明甲硫氨酸亚砜还原酶A（MsrA）是Ubl蛋白质修饰（sampylation）与UbaA一起在体内温和的氧化条件下和< （体外）（fu="">
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| Expression and Purification of a Mammalian P2X7 Receptor from Sf9 Insect Cells
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Author:
Date:
2017-09-05
[Abstract] The P2X7 receptor is an extracellular ATP-gated ion channel found only in eukaryotes (Bartlett et al., 2014). Due to its unique properties among P2X receptors, such as formation of a large conductance pore, the P2X7 receptor has been implicated in devastating diseases like chronic pain (North and Jarvis, 2013). However, mechanisms underlying the P2X7 specific properties remain poorly understood, partly because purification of this eukaryotic membrane protein has been challenging. Here we describe a detailed protocol for expressing and purifying a mammalian P2X7 receptor using an insect cell-baculovirus system. The P2X7 receptor is expressed in Sf9 insect cells as a GFP fusion protein and solubilized with a buffer containing Triton X-100 detergent. The P2X7-GFP fusion protein is ...
[摘要] P2X7受体是仅在真核生物中发现的胞外ATP门控离子通道（Bartlett等，2014）。由于其P2X受体之间的独特性质，例如大电导孔的形成，P2X7受体已经涉及破坏性疾病如慢性疼痛（North和Jarvis，2013）。然而，P2X7特异性属性的机制仍然知之甚少，部分原因是纯化这种真核膜蛋白是一个挑战。在这里，我们描述了使用昆虫细胞 - 杆状病毒系统表达和纯化哺乳动物P2X7受体的详细方案。 P2X7受体在作为GFP融合蛋白的Sf9昆虫细胞中表达，并用含有Triton X-100洗涤剂的缓冲液溶解。然后使用Strep-Tactin亲和层析在含有十二烷基麦芽糖苷的缓冲液中纯化P2X7-GFP融合蛋白。在通过凝血酶酶切割连接的GFP和Strep-标签后，使用大小排阻色谱分离P2X7受体。该方法通常从6L的Sf9培养物产生约2mg的纯化蛋白质。纯化的蛋白质可以用含有15％甘油的缓冲液在4℃下储存至少2个月，并用于各种功能和结构研究（Karasawa和Kawate，2016）。
【背景】P2X7受体是嘌呤能P2X受体家族的七种亚型之一，并且是广泛疾病如神经退行性疾病，癫痫和神经性疼痛的有希望的新型药物靶点（North和Jarvis，2013; Bhattacharya和Biber， ...
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