| Confocal Microscopy of Reovirus Transport in Living Dorsal Root Ganglion Neurons
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Author:
Date:
2020-11-20
[Abstract] Neurotropic reoviruses repurpose host machinery to traffic over long distances in neuronal processes and access distal replication sites. Understanding mechanisms of neuronal transmission is facilitated by using simplified in vitro primary neuronal culture models. Advances in the design of compartmentalized microfluidic devices lend robustness to neuronal culture models by enabling compartmentalization and manipulation of distinct neuronal processes. Here, we describe a streamlined methodology to culture sensory neurons dissociated from dorsal root ganglia of embryonic rats in microfluidic devices. We further describe protocols to exogenously label reovirus and image, track, and analyze transport of single reovirus particles in living neurons. These techniques can be adapted to study ...
[摘要] [摘要] 嗜神经性呼肠孤病毒重新利用宿主机器在神经元过程中进行长距离的传输，并进入远端复制部位。简化的体外原代神经元培养模型有助于理解神经元传递机制。室化微流控装置设计的进展使得不同的神经元过程能够被划分和操作，从而为神经元培养模型提供了稳健性。在这里，我们描述了一种在微流控装置中培养胚胎大鼠背根神经节分离的感觉神经元的方法。我们进一步描述了外源性标记呼肠孤病毒的方法，并对单个呼肠孤病毒粒子在活神经元中的转运进行了成像、跟踪和分析。这些技术可应用于研究其他嗜神经病毒的轴突定向转运以及参与信号传导和病理学的神经因子。
[背景]来自不同家族的病毒，包括黄病毒科、疱疹病毒科、小角RNA病毒科和弹状病毒科，突破神经系统的保护屏障，造成严重的疾病和经济负担（Koyuncu等人，2013年；Bohmwald等人，2018年；Tyler，2018年）。哺乳动物正呼肠孤病毒（reovirus，reovirus）属于呼肠孤病毒科，在多种年轻哺乳动物中引起血清型依赖性神经元感染，可导致致命性脑炎（Tyler等人，1986年；Dermody等人，2013年）。呼肠孤病毒没有被两个同心蛋白壳包裹的片段dsRNA基因组包裹，是研究神经系统病毒感染的一种灵活工具（Dermody等人，2013年）。虽然呼肠孤病毒感染的细胞和分子机制已被广泛地利用转化细胞系进行研究，但这些系统并不能捕捉到极化神经元细胞的复杂性。感染神经元的病毒必须在轴突中长距离传播，才能到达复制和释放的远端。为了了解呼肠孤病毒进入神经元和长距离运输的机制，我们最近采用了一些技术来培养原代神经元，并对活细胞中荧光标记的呼肠孤病毒成像（Aravamudhan等人，2020年）。 ...
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| Culture and Nucleofection of Postnatal Day 7 Cortical and Cerebellar Mouse Astroglial Cells
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Author:
Date:
2018-02-05
[Abstract] Lineage reprogramming of astroglial cells isolated from different brain regions leads to the generation of different neuronal subtypes. This protocol describes the isolation and culture of neocortical and cerebellar astrocytes from postnatal mice. We also present a comprehensive description of the main steps towards successful gene delivery in these cells using nucleofection. Neocortex and cerebellum astrocyte cultures obtained with these methods are suitable for the study of molecular and cellular mechanisms involved in direct cell lineage reprogramming into induced neurons (iNs).
[摘要] 从不同脑区分离的星形胶质细胞的谱系重编程导致产生不同的神经元亚型。 该协议描述了来自出生后小鼠的新皮质和小脑星形胶质细胞的分离和培养。 因此，我们全面描述了使用nucleofection在这些细胞中成功进行基因传递的主要步骤。 在涉及直接细胞谱系重编程为诱导神经元（iNs）的分子和细胞机制研究中获得的新皮质和小脑星形胶质细胞培养物。
【背景】文献中广泛描述了星形胶质细胞培养（Saura，2007，Schildge等人，2013）。几种方案，主要是细胞分离的步骤数不同，产生足够纯度的星形胶质细胞培养物（高达98％）。然而，大多数方案被描述为“关注从新皮层分离星形胶质细胞并使用化学解离”（Schildge等人，2013）。在这里，我们提供了一种替代方法来产生高浓缩的星形胶质细胞单层，而不需要化学组织解离，这使得方案比以前的方法更快。此外，我们强调新皮层和小脑星形胶质细胞的分离和培养，突出了这两个细胞群体之间的一些重要差异。最后，我们描述了使用核转染在星形胶质细胞中基因递送的替代的，成本有效的方法（Chouchane等人，2017）。该技术由使用特定电压和试剂的细胞电穿孔后直接递送DNA分子组成。与逆转录病毒介导的转染相比（Heines等，2002; Berninger等） / ，2007，Heinrich等人，2012; ...
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