| High-throughput YO-PRO-1 Uptake Assay for P2X7 Receptors Expressed in HEK Cells
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Author:
Date:
2018-07-20
[Abstract] P2X7 receptors are extracellular ATP-gated ion channels that play broad physiological and pathological roles in animals (Sluyter, 2017). Activation of P2X7 receptors lead to the opening of membrane channels permeable for small cations like Na+ and Ca2+ as well as fluorescent dyes such as YO-PRO-1 (Alves et al., 2014). Taking advantage of this dye-permeability, YO-PRO-1 uptake assays have been widely used to probe P2X7 receptor activity (Surprenant et al., 1996; Rassendren et al., 1997; Karasawa et al., 2017). Here we describe a step by step protocol for a high-throughput YO-PRO-1 uptake assay using HEK293 cells expressing P2X7 receptors. This 3-day protocol is particularly suited for examining effects of small molecules and ...
[摘要] P2X7受体是细胞外ATP门控离子通道，在动物中发挥广泛的生理和病理作用（Sluyter，2017）。 P2X7受体的激活导致膜通道的开放可渗透小阳离子如Na + 和Ca 2 + 以及荧光染料如YO-PRO-1（Alves） et al。，2014）。 利用这种染料渗透性，YO-PRO-1摄取试验已被广泛用于探测P2X7受体活性（Surprenant et al。，1996; Rassendren et al。 ，1997; Karasawa et al。，2017）。 在这里，我们描述了使用表达P2X7受体的HEK293细胞进行高通量YO-PRO-1摄取测定的逐步方案。 这个为期3天的方案特别适用于检查小分子和突变对P2X7受体功能的影响。 该协议改编自我们之前发表的论文（Karasawa和Kawate，2016）。
【背景】P2X7受体打开可渗透阳离子的膜通道（Surprenant et al。，1996; Sluyter，2017）。虽然电生理学仍然是量化P2X7受体活性的金标准，但这种专门技术可能并不容易获得。此外，电生理学不适合高通量筛选，因为每次记录需要大量的时间和操作。因此，荧光分子的摄取是一种广泛使用的替代方法，特别是用于筛选多种条件/突变体（Cankurtaran-Sayar et al。，2009; Qu et al。 ...
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| Multiple Stepwise Gene Knockout Using CRISPR/Cas9 in Escherichia coli
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Author:
Date:
2018-01-20
[Abstract] With the recent implementation of the CRISPR/Cas9 technology as a standard tool for genome editing, laboratories all over the world are undergoing one of the biggest advancements in molecular biology since PCR. The key advantage of this method is its simplicity and universal applicability for species of any phylum. Of particular interest is the extensively studied Gram-negative bacterium Escherichia coli, as it is considered as the workhorse for both research and industrial purposes. Here, we present a simple, robust and effective protocol using the CRISPR/Cas9 system in combination with the λ Red machinery for gene knockout in E. coli. Crucial in our procedure is the use of a double-stranded donor DNA and a curing strategy for removal of the guide RNA encoding plasmid ...
[摘要] 随着CRISPR / Cas9技术作为基因组编辑的标准工具的最近实施，全世界的实验室正在经历PCR以来分子生物学方面最大的进步之一。这种方法的关键优点是其简单和普遍适用于任何物种的门。特别感兴趣的是广泛研究的革兰氏阴性细菌大肠杆菌，因为它被认为是研究和工业用途的主力。在这里，我们提出了一个简单，强大和有效的协议，使用CRISPR / Cas9系统结合λ红色基因敲除机器。大肠杆菌。在我们的程序中最重要的是使用双链供体DNA和固化策略来去除导向RNA编码质粒，其允许在仅仅两个工作日后开始新的突变。我们的方案允许多个具有高诱变效率的基因敲除株，适用于高通量的方法。
【背景】革兰氏阴性细菌大肠杆菌是生物技术工程中最重要的生物之一。已在能源，农业，食品生产，生物技术，医药等不同行业的各种流程中成功实施。由于不断的技术进步，生物技术部门正在迅速发展。特别是，CRISPR / Cas9技术可能是PCR（分子）生物学最大的革命（Ledford，2015）。简而言之，CRISPR / Cas9保护细菌免受诸如质粒和病毒等侵入性遗传因子的影响（Marraffini，2015）。利用这种从原核生物获得的免疫系统，已经开发了基于CRISPR / Cas9系统的基因组编辑的非常有力的工具（Jinek等人，2012）。
CRISPR / ...
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| Markerless Gene Editing in the Hyperthermophilic Archaeon Thermococcus kodakarensis
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Author:
Date:
2017-11-20
[Abstract] The advent of single cell genomics and the continued use of metagenomic profiling in diverse environments has exponentially increased the known diversity of life. The recovered and assembled genomes predict physiology, consortium interactions and gene function, but experimental validation of metabolisms and molecular pathways requires more directed approaches. Gene function–and the correlation between phenotype and genotype is most obviously studied with genetics, and it is therefore critical to develop techniques permitting rapid and facile strain construction. Many new and candidate archaeal lineages have recently been discovered, but experimental, genetic access to archaeal genomes is currently limited to a few model organisms. The results obtained from manipulating the genomes of ...
[摘要] 单细胞基因组学的出现以及在不同环境中宏基因组分析的持续使用已经成倍地增加了已知的生命多样性。恢复和组装的基因组预测生理，财团相互作用和基因功能，但代谢和分子途径的实验验证需要更直接的方法。基因功能 - 表型和基因型之间的相关性用遗传学得到最明显的研究，因此开发允许快速和容易地构建应变的技术是至关重要的。最近已经发现了许多新的和候选的古细菌谱系，但是对古细菌基因组的实验性，遗传途径目前仅限于一些模式生物。操纵这些基因可获得的生物的基因组所获得的结果已经对我们对古菌生理和信息处理系统的理解产生了深远的影响，这些持续的研究也有助于解决生命树的系统发育重建。超嗜热，浮游，海洋异养古细菌Thermococcus kodakarensis已经成为理想的遗传系统，其具有一系列可用于增加或减少编码活性的技术或修饰基因在体内的表达 。我们在这里概述一些技术，可以快速，无标记地删除单个，或者重复删除几个连续的从 T的序列。 kodakarensis 基因组。我们的程序包括构建转化所必需的质粒DNA的细节，所述质粒DNA通过同源重组指导整合到基因组中，鉴定已经整合了质粒序列的菌株（称为中间菌株）和确认质粒切除，导致最终菌株中的目标基因。可以使用几乎相同的程序来修饰而不是删除基因组基因座。
【背景】古细菌常常在看起来荒凉和迅速变化的环境中繁衍生息。古菌基因组的分析揭示了大量的代谢策略，预测了复杂和高度相互依赖的基因表达的调控网络，并揭示了许多基因，其蛋白质和日益稳定的RNA产物缺乏确定的功能。通过遗传操作挑战现有的和定义新的途径的能力已经辅助了古细菌生理学和信息处理系统的去卷积，并且最近开放了古细菌物种到合成和系统级的方法来定义细胞内和细胞间网络。 ...
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