| Dissecting the Rat Mammary Gland: Isolation, Characterization, and Culture of Purified Mammary Epithelial Cells and Fibroblasts
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Author:
Date:
2020-11-20
[Abstract] With the advent of CRISPR-Cas and the ability to easily modify the genome of diverse organisms, rat models are being increasingly developed to interrogate the genetic events underlying mammary development and tumorigenesis. Protocols for the isolation and characterization of mammary epithelial cell subpopulations have been thoroughly developed for mouse and human tissues, yet there is an increasing need for rat-specific protocols. To date, there are no standard protocols for isolating rat mammary epithelial subpopulations. Analyzing changes in the rat mammary hierarchy will help us elucidate the molecular events in breast cancer, the cells of origin for breast cancer subtypes, and the impact of the tumor microenvironment. Here we describe several methods developed for 1) rat mammary ...
[摘要] [摘要]随着CRISPR-Cas的出现以及能够轻松修饰各种生物的基因组的能力，越来越多地开发大鼠模型来询问乳腺发育和肿瘤发生的遗传事件。已经为小鼠和人类组织彻底开发了用于分离和表征乳腺上皮细胞亚群的方案，但是对大鼠特异性方案的需求却在不断增长。迄今为止，还没有用于分离大鼠乳腺上皮亚群的标准方案。分析大鼠乳腺层次的变化将有助于我们阐明乳腺癌中的分子事件，乳腺癌亚型的起源细胞以及肿瘤微环境的影响。在这里，我们描述为1）大鼠乳腺上皮细胞分离开发的几种方法；2）大鼠乳腺成纤维细胞分离；3）培养大鼠乳腺上皮细胞；通过4）流式细胞仪分析和鉴定大鼠乳腺细胞；5）免疫荧光。源自该协议的细胞可用于多种目的，包括RNAseq ，药物研究，功能测定，基因/蛋白质表达分析和图像分析。
[背景]大多数与乳腺有关的研究都是在小鼠模型和人体样品中进行的。然而，由于其具有类似于人的药代动力学特征和乳腺发育，该疾病的大鼠模型正变得越来越流行（Russo等人，1990；Jiunn等人，2008； Smalley等人，2016）。像人类腺癌一样，大鼠乳腺癌也经历组织学发展阶段（Russo等，1990； Singh等，2000），并且是卵巢激素依赖性的（Thompson等，1998； ...
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| In vivo Mouse Mammary Gland Formation
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Author:
Date:
2020-07-05
[Abstract] For years, the mammary gland serves as a perfect example to study the self-renew and differentiation of adult stem cells, and the regulatory mechanisms of these processes as well. To assess the function of given genes and/or other factors on stemness of mammary cells, several In vitro assays were developed, such as mammospheres formation assay, detection of stem cell markers by mRNA expression or flow cytometry and so on. However, the capacity of reconstruction of whole mount in the cleared fat pad of recipient female mice is a golden standard to estimate the stemness of the cells. Here we described a step-by-step protocol for in vivo mammary gland formation assay, including preparation of “cleared” recipients and mammary cells for implantation, the surgery process and ...
[摘要] [摘要 ] 多年来，乳腺一直是研究成体干细胞的自我更新和分化以及这些过程的调控机制的完美例证。为了评估给定的基因和/或其他因素对乳腺细胞的干性，有几个函数体外测定法开发出来，如微球体由mRNA表达形成试验，干细胞标志物的检测或流式细胞术等。然而，在雌性小鼠清除的脂肪垫中整个坐骨的重建能力是估计细胞干性的黄金标准。在这里，我们描述了体内的分步操作方案 乳腺形成测定，包括准备“清除”的受体和用于植入的乳腺细胞，手术过程以及如何评估实验结果。结合通过基因编辑和/或药物处理对乳腺细胞的操作，该方案在乳腺干细胞和乳腺发育的研究中可能非常有用。
[背景 ] 作为哺乳动物最典型的器官之一，乳腺（MG）是外分泌腺，负责泌乳。MG的发育受某些性激素的控制，这些激素的水平精确地调节了MG在不同发育阶段的结构，细胞组成和功能变化（Henigighausen and Robinson，2005）。许多遗传和环境因素都参与了乳腺干细胞的调控和MG的发育。为了研究这些因素的功能和机理，已经开发了几种方法，特别是用于评估乳腺细胞的干性。先前的研究表明，只有MG的基底细胞而非管腔细胞能够在受体雌性小鼠清除的脂肪垫中重建上皮树，这表明乳腺干细胞仅存在于基底谱系中（Van Keymeulen 等，2011）。 ）。后来，包括我们在内的许多研究发现了乳腺干细胞的几种标志物（Prater ...
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| Deoxycholate Fractionation of Fibronectin (FN) and Biotinylation Assay to Measure Recycled FN Fibrils in Epithelial Cells
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Author:
Date:
2018-08-20
[Abstract] Fibronectin (FN) is an extracellular matrix protein that is secreted by many cell types and binds predominantly to the cell surface receptor Integrin α5β1. Integrin α5β1 binding initiates the step-wise assembly of FN into fibrils, a process called fibrillogenesis. We and several others have demonstrated critical effects of fibrillogenesis on cell migration and metastasis. While immunostaining and microscopy methods help visualize FN incorporation into fibrils, with each fibril being at least 3 μm in length, the first study that developed a method to biochemically fractionate FN to quantify fibril incorporated FN was published by Jean Schwarzbauer’s group in 1996. Our protocol was adapted from the original publication, and has been tested on multiple cell types including as shown here in ...
[摘要] 纤连蛋白（FN）是一种细胞外基质蛋白，由许多细胞类型分泌，主要与细胞表面受体整合素α5β1结合。整合素α5β1结合启动FN逐步组装成原纤维，这一过程称为原纤维形成。我们和其他几个人已经证明了原纤维形成对细胞迁移和转移的关键作用。虽然免疫染色和显微镜方法有助于可视化FN掺入原纤维，每个原纤维的长度至少为3μm，但是第一项研究开发了一种生物化学分离FN以量化原纤维并入FN的方法，由Jean Schwarzbauer小组于1996年出版。我们的方案改编自原始出版物，并已在多种细胞类型上进行测试，包括如此处所示的MCF10A乳腺上皮细胞和Caki-1肾癌上皮细胞。使用两种洗涤剂提取物，将细胞FN分离成不溶于洗涤剂或掺入原纤维的FN和可溶性FN或未掺入的级分。为了确定原纤维形成是否利用FN的再循环池，我们使用了生物素标记的FN（FN-生物素）再循环测定，其已经从先前的研究中修改。使用再循环测定和脱氧胆酸盐分离方法的组合，可以定量地证明在不同实验条件下细胞中原纤维形成的程度，并确定原纤维形成的FN来源
【背景】 纤连蛋白（FN）是普遍产生的细胞外基质（ECM）组分（Uitto et al。，1989; Mao和Schwarzbauer，2005）。纤连蛋白库是转录产生的，可以通过几种生长因子如TGF-β1增加（Yokoi et al。，2002; Mimura ...
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