| Polyamine Transport Assay Using Reconstituted Yeast Membranes
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Author:
Date:
2021-01-20
[Abstract] ATP13A2/PARK9 is a late endo-/lysosomal P5B transport ATPase that is associated with several neurodegenerative disorders. We recently characterized ATP13A2 as a lysosomal polyamine exporter, which sheds light on the molecular identity of the unknown mammalian polyamine transport system. Here, we describe step by step a protocol to measure radiolabeled polyamine transport in reconstituted vesicles from yeast cells overexpressing human ATP13A2. This protocol was developed as part of our recent publication (van Veen et al., 2020) and will be useful for characterizing the transport function of other putative polyamine transporters, such as isoforms of the P5B transport ATPases.
[摘要] [摘要] ATP13A2 / PARK9是一种晚期内/溶酶体P5B转运ATPase，与多种神经退行性疾病有关。我们最近将ATP13A2表征为溶酶体多胺出口者，这为未知的哺乳动物多胺转运系统的分子身份提供了线索。在这里，我们逐步描述了从过量表达人ATP13A2的酵母细胞中测量重组囊泡中放射性标记的多胺转运的方案。该方案是我们最新出版物的一部分（van Veen等，2020），将有助于表征其他假定的多胺转运蛋白的转运功能，例如P5B转运ATPase的同工型。
[背景] ATP13A2 / PARK9编码一种普遍表达的晚期内-/溶酶体膜蛋白，与一系列神经退行性疾病有关，例如早发性帕金森氏病（Di Fonzo等，2007 ；Lin等，2008）和Kufor -Rakeb综合征（伴痴呆的早期帕金森病）（Ramirez等，2006 ；Park等，2011）。ATP13A2属于P型转运ATPase ，是一类活性转运蛋白，由于ATP水解而暂时形成磷酸中间产物（Kuhlbrandt ，2004年）。ATP13A2是P5亚家族的成员，该家族已在20多年前通过基因组测序鉴定出来（Axelsen和Palmgren ...
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| A Method for SUMO Modification of Proteins in vitro
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Author:
Date:
2018-10-05
[Abstract] The Small Ubiquitin-related Modifier (SUMO) is a protein that is post-translationally added to and reversibly removed from other proteins in eukaryotic cells. SUMO and enzymes of the SUMO pathway are well conserved from yeast to humans and SUMO modification regulates a variety of essential cellular processes including transcription, chromatin remodeling, DNA damage repair, and cell cycle progression. One of the challenges in studying SUMO modification in vivo is the relatively low steady-state level of a SUMO-modified protein due in part to the activity of SUMO deconjugating enzymes known as SUMO Isopeptidases or SENPs. Fortunately, the use of recombinant SUMO enzymes makes it possible to study SUMO modification in vitro. Here, we describe a sensitive method for ...
[摘要] 小泛素相关修饰物（SUMO）是一种蛋白质，其翻译后添加到真核细胞中并可逆地从其他蛋白质中去除。 SUMO和SUMO途径的酶从酵母到人类都很保守，SUMO修饰调节了多种基本细胞过程，包括转录，染色质重塑，DNA损伤修复和细胞周期进程。 研究SUMO修饰体内的挑战之一是SUMO修饰蛋白的相对低的稳态水平，部分原因是SUMO去缀合酶（SUMO Isopeptidases或SENPs）的活性。 幸运的是，使用重组SUMO酶可以在体外研究SUMO修饰。 在这里，我们描述了一种灵敏的方法，用于检测目标人类蛋白质的SUMO修饰，使用来自兔网织红细胞和放射性标记的氨基酸的体外转录和翻译系统。
【背景】与其他泛素蛋白家族修饰一样，SUMO修饰通过ATP依赖性酶促级联发生，涉及E1激活酶（人类中的Aos1 / Uba2异二聚体），E2结合酶（Ubc9）和许多E3连接之一的连续活性。酶（Gareau和Lima，2010）。具有SUMO缀合共有位点的蛋白质ΨKxE（Ψ是疏水残基，其后是赖氨酸，任何氨基酸和谷氨酸），可以通过哺乳动物中表达的一种或几种SUMO旁系同源物（包括SUMO1，SUMO2）进行有效修饰。或SUMO3（统称为SUMO2 / 3，因为它们的序列同源性为97％）（Gareau和Lima，2010; Flotho和Melchior，2013）。 ...
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| Easy and Efficient Permeabilization of Cyanobacteria for in vivo Enzyme Assays Using B-PER
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Author:
Date:
2018-01-05
[Abstract] Cyanobacteria are photosynthetic bacteria that thrive in diverse ecosystems and play major roles in the global carbon cycle. The abilities of cyanobacteria to fix atmospheric CO2 and to allocate the fixed carbons to chemicals and biofuels have attracted growing attentions as sustainable microbial cell factories. A better understanding of activities of enzymes involved in the central carbon metabolism might lead to increased product yields. Currently, cell-free lysates are widely used for the determination of intracellular enzyme activities. However, due to thick cell walls in cyanobacteria, lysis of cyanobacterial cells is inefficient and often laborious. The present protocol describes an easy and efficient method to permeabilize cyanobacterial cells, without lysing them, and ...
[摘要] 蓝细菌是光合细菌，在不同的生态系统中繁衍，在全球碳循环中发挥重要作用。 蓝藻固定大气CO 2和将固定碳分配到化学品和生物燃料的能力作为可持续的微生物细胞工厂已经引起越来越多的关注。 更好地了解参与中央碳代谢的酶的活性可能导致产物产量增加。 目前，无细胞裂解物被广泛用于细胞内酶活性的测定。 然而，由于蓝细菌细胞壁较厚，蓝细菌细胞的裂解效率低下且费力。 目前的方案描述了一种简单而有效的方法来渗透蓝藻细胞，而不溶解它们，并直接使用透化细胞来测定体内代谢酶活性。
【背景】我们之前已经报道了使用B-PER TM试剂（Thermo Fisher Science）（Rasmussen等人，2016）简单，有效且可扩展的蓝细菌的透化。 B-PER TM TM试剂含有溶解在Tris-HCl缓冲液中的未公开的温和洗涤剂，通常用于裂解细菌细胞如大肠杆菌（Escherichia coli）。偶然地，我们发现B-PER TM TM试剂渗透蓝细菌细胞而不是溶解它们，可能是因为厚的蓝细菌细胞壁（Hoiczyk和Hansel，2000）赋予了试剂中使用的去污剂的抗性。在生物技术感兴趣的蓝细菌中进行通透化。聚球蓝细菌PCC 7002（以下简称“Synechococcus”7002）和“Synechocystis”sp。 PCC ...
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