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XCell SureLockTM Mini-Cell

XCell SureLock ® Mini-Cell

Company: Thermo Fisher Scientific
Catalog#: EI0001
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In vitro Enzymatic Assays of Histone Decrotonylation on Recombinant Histones
Author:
Date:
2018-07-20
[Abstract]  Class I histone deacetylases (HDACs) are efficient histone decrotonylases, broadening the enzymatic spectrum of these important (epi-)genome regulators and drug targets. Here, we describe an in vitro approach to assaying class I HDACs with different acyl-histone substrates, including crotonylated histones and expand this to examine the effect of inhibitors and estimate kinetic constants. [摘要]  I类组蛋白去乙酰化酶(HDACs)是有效的组蛋白去蛋白酶,拓宽了这些重要(epi-)基因组调节因子和药物靶标的酶谱。 在这里,我们描述了一种体外方法来测定具有不同酰基 - 组蛋白底物的I类HDAC,包括巴豆酰化组蛋白,并将其扩展以检查抑制剂的作用并估计动力学常数。

【背景】组蛋白的翻译后修饰是基因组调控的重要方面,包括基因表达(例如参见Pengelly et al。,2013;在Castillo 等人中综述,2017)。组蛋白修饰改变染色质结构和/或调节蛋白质的结合,例如核小体重塑因子(在Bannister和Kouzarides,2011中综述)。大多数组蛋白修饰是可逆的并且可以酶促去除。例如,通过组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)除去组蛋白乙酰化,其中存在几类。近年来,新的组蛋白赖氨酸酰化,包括琥珀酰化,丙酰化,丁酰化,羟基丁基化和巴豆酰化已成为规范组蛋白乙酰化的新替代物,并且已经证实了许多这些新发现的组蛋白修饰的功能相关性(Sabari 等人,2017)。特别是,组蛋白巴豆酰化与活性基因表达有关,并被认为受细胞代谢状态的影响(Sabari et al。,2015; Fellows et al。 ,2018年)。最近已显示I类组蛋白脱乙酰酶也有效地去除组蛋白质(Wei et al。,2017; Fellows et al。,2018)。
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A Small RNA Isolation and Sequencing Protocol and Its Application to Assay CRISPR RNA Biogenesis in Bacteria
Author:
Date:
2018-02-20
[Abstract]  Next generation high-throughput sequencing has enabled sensitive and unambiguous analysis of RNA populations in cells. Here, we describe a method for isolation and strand-specific sequencing of small RNA pools from bacteria that can be multiplexed to accommodate multiple biological samples in a single experiment. Small RNAs are isolated by polyacrylamide gel electrophoresis and treated with T4 polynucleotide kinase. This allows for 3’ adapter ligation to CRISPR RNAs, which don’t have pre-existing 3’-OH ends. Pre-adenylated adapters are then ligated using T4 RNA ligase 1 in the absence of ATP and with a high concentration of polyethylene glycol (PEG). The 3’ capture step enables precise determination of the 3’ ends of diverse RNA molecules. Additionally, a random hexamer in the ligated ... [摘要]  新一代高通量测序技术能够对细胞中的RNA群体进行敏感和明确的分析。在这里,我们描述了一种从细菌中分离和链特异性测序小RNA池的方法,所述细菌可以在单个实验中多路复用以容纳多个生物样品。小RNA通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并用T4多核苷酸激酶处理。这允许3'衔接头连接至CRISPR RNA,其不具有预先存在的3'-OH末端。然后使用T4 RNA连接酶1在不存在ATP和高浓度聚乙二醇(PEG)的情况下将前腺苷酸化的衔接子连接。 3'捕获步骤能够精确测定不同RNA分子的3'末端。此外,连接适配器中的随机六聚体有助于控制潜在的下游扩增偏差。逆转录后,将cDNA产物环化并通过PCR制备文库。我们显示扩增的文库不需要通过凝胶电泳可见,以期望产物的有效测序。使用这种方法,我们通常从少量纯化的小RNA制备RNA测序文库。该协议适合于通过对成熟的CRISPR RNA进行测序来测定细菌中的CRISPR RNA生物合成,但可以用于测序不同类型的小RNA。我们还提供了一个完整的数据处理管道示例,并提供了运行所提供脚本的说明。


【背景】与聚集的经常散布的短回文重复序列(CRISPR)相关的遗传模块赋予不同的原核宿主适应性免疫(Barrangou et ...

Detection of Intracellular Reduced (Catalytically Active) SHP-1 and Analyses of Catalytically Inactive SHP-1 after Oxidation by Pervanadate or H2O2
Author:
Date:
2018-01-05
[Abstract]  Oxidative inactivation of cysteine-dependent Protein Tyrosine Phosphatases (PTPs) by cellular reactive oxygen species (ROS) plays a critical role in regulating signal transduction in multiple cell types. The phosphatase activity of most PTPs depends upon a ‘signature’ cysteine residue within the catalytic domain that is maintained in the de-protonated state at physiological pH rendering it susceptible to ROS-mediated oxidation. Direct and indirect techniques for detection of PTP oxidation have been developed (Karisch and Neel, 2013). To detect catalytically active PTPs, cell lysates are treated with iodoacetyl-polyethylene glycol-biotin (IAP-biotin), which irreversibly binds to reduced (S-) cysteine thiols. Irreversible oxidation of SHP-1 after treatment of cells with ... [摘要]  细胞活性氧(ROS)对半胱氨酸依赖性蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)的氧化失活在调节多种细胞类型的信号转导中起关键作用。大多数PTP的磷酸酶活性取决于催化结构域内的“标记”半胱氨酸残基,其在生理pH下保持质子化状态,使其易受ROS介导的氧化。已经开发了用于检测PTP氧化的直接和间接技术(Karisch和Neel,2013)。为了检测催化活性的PTP,用碘乙酰 - 聚乙二醇 - 生物素(IAP-生物素)处理细胞裂解物,所述碘乙酰 - 聚乙二醇 - 生物素(IAP-生物素)不可逆地结合还原的(S-5)半胱氨酸硫醇。使用对磺酸(SO 3)特异性的抗体检测用过钒酸盐或H 2 O 2 2处理细胞后SHP-1的不可逆氧化, H)形式的PTP的保守的活性位点半胱氨酸。在该协议中,我们描述了用于检测造血PTP SHP的还原(S ; active)或不可逆氧化(SO 3 H;非活性)形式的方法-1,尽管这种方法适用于任何细胞类型中的任何半胱氨酸依赖性PTP。

【背景】活性氧(ROS)由细胞NADPH氧化酶和线粒体产生。大多数蛋白质酪氨酸磷酸酶(PTP)含有保守的催化半胱氨酸,其具有低的解离常数(pKa),其对ROS的氧化非常敏感(Rudyk和Eaton,2014)。 PTP的ROS失活在许多细胞类型中调节酪氨酸激酶介导的信号传导反应中起重要作用。在用ROS H 2 O ...

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