| Robust Generation of Knock-in Cell Lines Using CRISPR-Cas9 and rAAV-assisted Repair Template Delivery
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Author:
Date:
2017-04-05
[Abstract] The programmable Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-associated nuclease 9 (Cas9) technology revolutionized genome editing by providing an efficient way to cut the genome at a desired location (Ledford, 2015). In mammalian cells, DNA lesions trigger the error-prone non-homologous end joining (NHEJ) DNA repair mechanism. However, in presence of a DNA repair template, Homology-Directed Repair (HDR) can occur leading to precise repair of the lesion site. This last process can be exploited to enable precise knock-in changes by introducing the desired genomic alteration on the repair template. In this protocol we describe the delivery of long repair templates (> 200 nucleotides) using recombinant Adeno Associated Virus (rAAV) for CRISPR-Cas9-based knock-in of a ...
[摘要] 可编程集群定期间隔短回归度（CRISPR）相关核酸酶9（Cas9）技术通过提供在所需位置切割基因组的有效方式，彻底改变了基因组编辑（Ledford，2015）。 在哺乳动物细胞中，DNA损伤触发易发生非同源末端连接（NHEJ）DNA修复机制。 然而，在DNA修复模板的存在下，可以发生同源性定向修复（HDR），导致病变部位的精确修复。 可以利用最后的方法，通过在修复模板上引入所需的基因组改变来实现精确的敲入变化。 在本协议中，我们描述了使用重组腺相关病毒（rAAV）在人细胞系中进行基于CRISPR-Cas9的C-末端标签序列敲入的长修复模板（> 200个核苷酸）的递送。
尽管有关CRISPR-Cas9产生的敲门模型系统的大量报告，敲门砖报告仍然落后。由于许多应用，产生敲入细胞系仍然是基因组编辑的明显目标。敲入改变的引入通常依赖于修复模板DNA的存在，并且在位点特异性双链（ds）DNA断裂被引入接近改变位点的基因组中后，HDR修复机制的激活。不同的模板可以传送到修复机器，范围从含有广泛同源区域和可选选择盒的经典线性化载体到约200个核苷酸的单链（ss）DNA寡核苷酸（Chen等人， ...
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| Detection of Wnt5 in Media Conditioned by Mouse Embryonic Fibroblast
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Author:
Date:
2016-10-20
[Abstract] This protocol describes the procedure of visualizing secreted Wnt5 protein in serum free media via western blotting. This procedure can also be used to visualize other secreted proteins larger than 10,000 daltons. The work presented in this paper visualizes Wnt5 secreted by mouse embryonic fibroblast (MEF), but can be adapted to other cell lines including those transiently transfected by plasmids.
[摘要] 该协议描述了通过免疫印迹观察无血清培养基中分泌的Wnt5蛋白的过程。 该程序还可用于显现大于10,000道尔顿的其他分泌的蛋白质。 本文提出的工作可视化由小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）分泌的Wnt5，但可以适应于其他细胞系，包括由质粒瞬时转染的那些。
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