| A One-enzyme RT-qPCR Assay for SARS-CoV-2, and Procedures for Reagent Production
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Author:
Date:
2021-01-20
[Abstract] Given the scale of the ongoing COVID-19 pandemic, the need for reliable, scalable testing, and the likelihood of reagent shortages, especially in resource-poor settings, we have developed an RT-qPCR assay that relies on an alternative to conventional viral reverse transcriptases, a thermostable reverse transcriptase/DNA polymerase (RTX) (Ellefson et al., 2016). Here we show that RTX performs comparably to the other assays sanctioned by the CDC and validated in kit format. We demonstrate two modes of RTX use – (i) dye-based RT-qPCR assays that require only RTX polymerase, and (ii) TaqMan RT-qPCR assays that use a combination of RTX and Taq DNA polymerases (as the RTX exonuclease does not degrade a TaqMan probe). We also provide straightforward recipes for the purification of this ...
[摘要] [摘要]鉴于持续进行的COVID-19大流行的规模，可靠，可扩展的测试需求以及试剂短缺的可能性（尤其是在资源匮乏的环境中），我们开发了一种n RT-qPCR分析方法，该方法依赖于其他方法与常规病毒逆转录酶相比，热稳定的逆转录酶/ DNA聚合酶（RTX）（Ellefson等，2016）。在这里，我们显示RTX与CDC认可并以试剂盒形式验证的其他检测方法具有可比性。我们演示了两种RTX使用模式-（i）仅需要RTX聚合酶的基于染料的RT-qPCR分析，以及（ii）使用RTX和Taq DNA聚合酶组合的TaqMan RT-qPCR分析（因为RTX核酸外切酶不降级ea TaqMan探针）。我们还提供了纯化该替代试剂RTX的简单方法。我们预计，在资源匮乏或需要的地方，研究人员可以获取可用的构建体，并开始开发自己的测定方法，而不论它们存在的调控框架如何。
[背景]尽管已采用多种病毒检测方法来检测SARS-CoV-2感染，包括各种分子诊断和免疫诊断测试，但逆转录酶定量聚合酶链反应（RT-qPCR）仍然是主要且最敏感的方法SARS-CoV-2检测试验（D'Cruz等，2020 ; Tang等，2020 ）。RT-qPCR的首要地位在很大程度上是因为基于抗体的测试以及快速核酸诊断平台（如Abbott ...
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| Lentiviral Knockdown of Transcription Factor STAT1 in Peromyscus leucopus to Assess Its Role in the Restriction of Tick-borne Flaviviruses
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Author:
Date:
2017-12-05
[Abstract] Cellular infection with tick-borne flaviviruses (TBFVs) results in activation of the interferon (IFN) signaling pathway and subsequent upregulation of numerous genes termed IFN stimulated genes (ISGs) (Schoggins et al., 2011). Many ISGs function to prevent virus pathogenesis by acting in a broad or specific manner through protein-protein interactions (Duggal and Emerman, 2012). The potency of the IFN signaling response determines the outcome of TBFV infection (Best, 2017; Carletti et al., 2017). Interestingly, data from our lab show that TBFV replication is significantly restricted in cells of the reservoir species Peromyscus leucopus thereby suggesting a potent antiviral response (Izuogu et al., 2017). We assessed the relative contribution of IFN ...
[摘要] 蜱传黄热病病毒（TBFV）的细胞感染导致干扰素（IFN）信号传导途径的激活和随后称为IFN刺激基因（ISG）（Schoggins等人，2011）的众多基因的上调。许多ISG通过蛋白质 - 蛋白质相互作用以广泛或特定的方式起作用来防止病毒发病（Duggal和Emerman，2012）。 IFN信号反应的效力决定了TBFV感染的结果（Best，2016; Carletti等人，2017）。有趣的是，我们实验室的数据显示TBFV复制在储库物种Peromyscus leucopus的细胞中显着受到限制，从而表明有效的抗病毒应答（Izuogu等人，2017）。我们评估干扰素信号对抗性的相对贡献。通过敲低IFN反应途径中的主要转录因子来抑制白血病。信号转导和转录激活因子1（STAT1）是专门针对在P。 leucopus细胞通过shRNA技术。我们进一步测试了基因敲低对细胞对IFN反应和限制病毒复制的能力的影响;结果表明当STAT1表达被改变时，leucopus细胞对IFN刺激的反应降低，并且对TBFV复制显着更敏感。
【背景】IFN信号是抵抗侵入宿主细胞的黄病毒的第一道防线（Robertson等人，2009; Lazear和Diamond，2015）。通过模式识别受体（PRR）检测与病毒颗粒相关的分子标记，然后通过转录因子引发下游信号从细胞释放1型IFN（Kawai ...
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