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Author:
Date:
2016-10-20
[Abstract] Dissecting the interactions established between proteins and membranes in a given type of cells is not an easy task. Using a cell-free system of large unilamellar vesicles (LUVs) to analyze these interactions may help decipher these interactions and identify potential membrane deformations induced by the proteins incubated with these LUVs. This article describes the protocols for 1) extraction of total lipids from eukaryotic cells using the method developed by Bligh and Dyer (1959), 2) the quantification of glycerophospholipids by gas chromatography after methanolysis, followed by 3) the formation of LUVs by extrusion, 4) protein-lipid binding assay, 5) analysis of the incubation product by transmission electron microscopy (TEM) and by flotation across a discontinuous sucrose gradient and ...
[摘要] 解剖在给定类型的细胞中蛋白质和膜之间建立的相互作用不是一个容易的任务。使用大单层囊泡（LUV）的无细胞系统来分析这些相互作用可以帮助破译这些相互作用和识别由与这些LUV孵育的蛋白质诱导的潜在的膜变形。本文介绍了1）使用由Bligh和Dyer（1959）开发的方法从真核细胞中提取总脂质，2）在甲醇分解后通过气相色谱法定量甘油磷脂，然后3）通过挤出形成LUV的方案， 4）蛋白质 - 脂质结合测定，5）通过透射电子显微镜（TEM）和通过不连续蔗糖梯度浮选分析孵育产物，最后，6）通过免疫印迹分析蛋白质并通过碘素熏蒸显示甘油磷脂。
[背景] 包含巨单层囊泡（GUV;由单个磷脂双层组成，直径大于1μm）或脂质体孵育的无细胞系统与重组蛋白可能有助于了解这些相互作用。根据它们的直径和层数，脂质体被分为小的单层囊泡（SUV;由单个磷脂双层构成的囊泡，直径在20和100nm之间），大的单层囊泡（LUV;由单个双层磷脂，并且直径在100和400nm之间），大多层囊泡（MLV;由多个磷脂双层构成且直径在200nm和3μm之间的囊泡）和多泡囊泡（MVV）;由囊泡组成的大囊泡单个双层磷脂，并含有几个较小的囊泡，每个囊泡由单个双层磷脂组成）。 ...
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