| Targeted Mutagenesis Using RNA-guided Endonucleases in Mosses
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Author:
Date:
2017-06-20
[Abstract] RNA-guided endonucleases (RGENs) have been used for genome editing in various organisms. Here, we demonstrate a simple method for performing targeted mutagenesis and genotyping in a model moss species, Physcomitrella patens, using RGENs. We also performed targeted mutagenesis in a non-model moss, Scopelophilla cataractae, using a similar method (Nomura et al., 2016), indicating that this experimental system could be applied to a wide range of mosses species.
[摘要] RNA引导的核酸内切酶（RGENs）已被用于各种生物体的基因组编辑。 在这里，我们展示了使用RGENs在模型苔藓种类小立碗藓中进行定向诱变和基因分型的简单方法。 我们还使用类似的方法（Nomura等，2016）在非模型苔藓，Scopelophilla白内障中进行了定向诱变，表明该实验系统可以应用于广泛的苔藓物种。
【背景】使用来自适应性免疫系统的RNA引导内切核酸酶（RGEN）的靶向诱变，使用细菌CRISPR（定期间隔的回文重复序列）/ Cas（CRISPR相关）系统近年来已经急剧发展。在该方法中，使用源自化脓性链球菌的Cas9核酸内切酶和人工设计的单链导向RNA（sgRNA）。 Cas9-sgRNA复合物识别原始相邻基序（5'-NGG-3'），并在目标位点上游3 bp切割（Jinek等，2012）。随后，在DNA的双链断裂（DSB）修复过程中发生随机插入和/或缺失突变。使用这些RGEN的定向诱变是有效的以及成本和时间有效的，它已被用于各种生物体（包括许多植物物种）的基因组编辑。在这里，我们在青苔中建立了使用RGEN进行靶向诱变的方案，并在模型和非模型物种中进行了证明（Nomura等，2016）。
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| Ultradeep Pyrosequencing of Hepatitis C Virus to Define Evolutionary Phenotypes
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Author:
Date:
2017-05-20
[Abstract] Analysis of hypervariable regions (HVR) using pyrosequencing techniques is hampered by the ability of error correction algorithms to account for the heterogeneity of the variants present. Analysis of between-sample fluctuations to virome sub-populations, and detection of low frequency variants, are unreliable through the application of arbitrary frequency cut offs. Cumulatively this leads to an underestimation of genetic diversity. In the following technique we describe the analysis of Hepatitis C virus (HCV) HVR1 which includes the E1/E2 glycoprotein gene junction. This procedure describes the evolution of HCV in a treatment naïve environment, from 10 samples collected over 10 years, using ultradeep pyrosequencing (UDPS) performed on the Roche GS FLX titanium platform (Palmer et al. ...
[摘要] 使用焦磷酸测序技术的高变区（HVR）分析受到纠错算法解释存在的变异异质性的能力的阻碍。通过应用任意频率切断，对样本间波动与色情子群体的分析以及低频变体的检测是不可靠的。累积地导致遗传多样性的低估。在以下技术中，我们描述了包含E1 / E2糖蛋白基因连接的丙型肝炎病毒（HCV）HVR1的分析。该程序描述了HCV在治疗初始环境中的演变，从10年来收集的10个样品中，使用在Roche GS FLX钛平台上进行的超深度焦磷酸测序（UDPS）（2014年，Palmer等人） 。使用血清样品的初步克隆分析来通知允许达到更大序列深度的下游误差校正算法。已经针对HCV基因型1,2,3和4测试了该区域的PCR扩增。
背景 衍生自病毒扩增子的UDPS数据集的分析经常依赖于未针对扩增子分析进行优化的软件工具，假设随机并入测序突变，并且集中在找到真实序列而不是假变异体。存在于RNA病毒基因组中的高变区存在这些困难。许多利用UDPS的研究通过对数据应用任意的频率切断来寻求解决这些问题，从而导致小的变体的丢失。在这里，暂时匹配的克隆数据集以及旨在克服所概述的问题的纠错方法，有助于保留有价值的序列信息。
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| RNA Editing Detection by Direct Sequencing
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Author:
Date:
2015-03-05
[Abstract] RNA editing is a widespread post-transcriptional phenomenon through which primary RNA sequences are altered by nucleotide insertion/deletion or base conversion. It occurs in a variety of organisms and cooperates with alternative splicing in increasing both proteomic and transcriptomic complexity. We describe here a method allowing RNA editing events detection by performing direct sequencing of both genomic DNA and cDNA from the same source.
[摘要] RNA编辑是广泛的转录后现象，通过其通过核苷酸插入/缺失或碱基转化来改变初级RNA序列。 它发生在多种生物体中，并与增加蛋白质组和转录组复杂性的可变剪接协作。 我们在这里描述一种允许通过对来自相同来源的基因组DNA和cDNA进行直接测序来进行RNA编辑事件检测的方法。
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