| ChIP-seq Experiment and Data Analysis in the Cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803
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Author:
Date:
2018-06-20
[Abstract] Nitrogen is an essential nutrient for all living organisms. In cyanobacteria, a group of oxygenic photosynthetic bacteria, nitrogen homeostasis is maintained by an intricate regulatory network around the transcription factor NtcA. Although mechanisms controlling NtcA activity appear to be well understood, the sets of genes under its control (i.e., its regulon) remain poorly defined. In this protocol, we describe the procedure for chromatin immunoprecipitation using NtcA antibodies, followed by DNA sequencing analysis (ChIP-seq) during early acclimation to nitrogen starvation in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 (hereafter Synechocystis). This protocol can be extended to analyze any DNA-binding protein in cyanobacteria for which suitable antibodies ...
[摘要] 氮是所有生物体的必需营养素。 在蓝细菌中，一组含氧光合细菌通过围绕转录因子NtcA的错综复杂的调节网络维持氮稳态。 尽管控制NtcA活性的机制似乎已被很好地理解，但其控制下的基因集（即它的调节子）仍然没有很好的定义。 在该协议中，我们描述了使用NtcA抗体进行染色质免疫沉淀的过程，随后在蓝藻Synechocystis sp。早期适应氮饥饿期间进行DNA测序分析（ChIP-seq）。 PCC 6803（以下简称<集气囊）。 该协议可以扩展到分析蓝细菌中存在合适抗体的任何DNA结合蛋白。
【背景】为了维持体内平衡，细菌经常需要响应环境变化来调整基因表达。许多这些调整是由转录因子（TF）控制的，这些转录因子可以感知代谢信号并激活或抑制目标基因。然而，反映传统上费力的任务来表征TFs在体内的活性和范围，我们对它们在细菌中的结合位点的了解仍然有限。直到最近，染色质免疫沉淀与高通量测序分析的结合为快速确定基因组水平调节子打开了大门。特别是，ChIP-seq使用下一代测序（NGS）的能力来并行识别大量DNA序列。与微阵列相比，ChIP-seq的一个有吸引力的特征是对某些区域如启动子序列没有限制，并且可以研究整个基因组的TF结合位点。
在蓝细菌中，氮同化和代谢的全球调节剂是NtcA，属于CRP（cAMP受体蛋白）家族的TF（Herrero等人，2001）。在集胞蓝细菌中，NtcA通过将二聚体结合至包含共有序列GTAN ...
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| A Reliable Assay to Evaluate the Virulence of Aspergillus nidulans Using the Alternative Animal Model Galleria mellonella (Lepidoptera)
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Author:
Date:
2017-06-05
[Abstract] The greater wax moth Galleria mellonella has emerged as an effective heterologous host to study fungal pathogenesis and the efficacy of promising antifungal drugs (Mylonakis et al., 2005; Li et al., 2013). Here, a methodology describing the Aspergillus nidulans infection in G. mellonella larvae, along with insect survival analysis, is reported. This protocol allowed the distinction between virulent A. nidulans strains (such as TNO2A3), which induced high larval mortality rates, to those in which gene deletion was accompanied by reduced pathogenicity such as ∆gcsA and ∆sdeA (Fernandes et al., 2016).
[摘要] 作为一种有效的异源宿主，越来越多的蜡蛾已经出现了一种有效的异源宿主，用于研究真菌发病机制和有希望的抗真菌药物的功效（Mylonakis等人，2005; Li＆ et al。2013）。这里，描述了一种描述构巢曲霉感染的方法。 mellonella 幼虫与昆虫存活分析一起报道。该协议允许区分有毒的 A。造成高幼虫死亡率的构巢组织菌株（如TNO2A3）与基因缺失伴随着致病性降低的病例如ΔGCA和ΔSAA（Fernandes 等人，2016）。
背景 -G。 mellonella 是一种廉价的模型，易于处理，其先天免疫反应与哺乳动物免疫系统分享功能相似性。此外，感染真菌突变菌株的幼虫和小鼠表现出相似的存活率（Brennan等人，2002）。因此，幼虫构成了一种方便的动物宿主，用于在真菌发病机理分析中代替脊椎动物的使用。尽管昆虫模型具有所有优点，但只有少数报告显示了G中曲霉菌感染的作用。蜡螟。该协议描述了一种有效的方法，用于分析G中的构巢曲霉发病机制。 mellonella 幼虫。
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| Antibiotic Disc Assay for Synechocystis sp. PCC6803
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2016-12-20
[Abstract] This protocol describes how to investigate the integrity of the outer cell wall in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC6803 using antibiotics. It is adapted to the agar diffusion test (Bauer et al., 1966), in which filter paper discs impregnated with specified concentrations of antibiotics were placed on agar plates inoculated with bacteria. The antibiotics we tested, interfering with the biosynthesis/function of bacterial cell walls, will diffuse into the agar and produce a zone of cyanobacterial growth inhibition around the disc(s). The size of the inhibition zone reflects the sensitivity of the strain to the action of antibiotics, e.g., a mutation in a protein functioning within the cell wall or its construction would render the mutant strain more ...
[摘要] 该协议描述了如何研究蓝藻中的外细胞壁的完整性。 PCC6803使用抗生素。适用于琼脂扩散试验（Bauer等人，1966），其中将浸渍有特定浓度的抗生素的滤纸盘放置在接种细菌的琼脂平板上。我们测试的抗生素，干扰细菌细胞壁的生物合成/功能，将扩散到琼脂中，并在盘周围产生蓝藻生长抑制区。抑制区的大小反映了菌株对抗生素作用的敏感性，例如，在细胞壁内起作用的蛋白质的突变或其构建将使得突变菌株对相应的抗生素。已经证明该方法可用于表型集胞藻（Synechocystis）突变体的表型。 PCC6803缺乏编码Deg蛋白酶的所有三种基因。显示这些不依赖于ATP的丝氨酸蛋白酶的缺失会影响集胞藻细胞的外细胞层（Cheregi等，2015）。
背景 蓝藻属集胞藻PCC6803（以下简称集胞藻6803）是研究光合作用过程的模式生物。虽然其基因组已经在1996年进行了测序，但仍有超过50％的基因编码具有假设或未知功能的蛋白质。三个基因slr1204 （ htrA ）， sll1679 （ hhoA ）和 sll1427 编码hEB的丝氨酸蛋白酶（周质蛋白质降解）家族;尽管进行了详细的分析（参见Cheregi等人，2016和其中的参考文献），它们的准确的亚细胞定位和底物仍然是神秘的。在我们实验室中进行的单个和三重缺失突变体的先前的蛋白质组学和代谢组学表征已经显示出具有在集胞藻6803（Miranda）的外细胞层中或上方的功能的蛋白质的表达改变 ...
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