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Date:
2017-10-20
[Abstract] In this protocol, engineered Cas9-ribonucleoprotein (Cas9 protein and sgRNA, together called Cas9-RNP) and gold nanoparticles are used to make nanoassemblies that are employed to deliver Cas9-RNP into cell cytoplasm and nucleus. Cas9 protein is engineered with an N-terminus glutamic acid tag (E-tag or En, where n = the number of glutamic acid in an E-tag and usually n = 15 or 20), C-terminus nuclear localizing signal (NLS), and a C-terminus 6xHis-tag. [Cas9En hereafter]
To use this protocol, the first step is to generate the required materials (gold nanoparticles, recombinant Cas9En, and sgRNA). Laboratory-synthesis of gold nanoparticles can take up to a few weeks, but can be synthesized in large batches that can be used for many years without compromising the quality. Cas9En ...
[摘要] 在该方案中，使用工程化的Cas9-核糖核蛋白（Cas9蛋白和sgRNA，一起称为Cas9-RNP）和金纳米颗粒制备用于将Cas9-RNP递送至细胞质和细胞核的纳米组件。 Cas9蛋白用N末端谷氨酸标签（E标签或En，其中n = E-标签中的谷氨酸数目，通常n = 15或20），C末端核定位信号（NLS） ，和C末端6xHis标签。 [Cas9En]
为了使用该方案，第一步是产生所需的材料（金纳米颗粒，重组Cas9En和sgRNA）。金纳米颗粒的实验室合成可能需要长达数周，但可以批量合成，可以使用多年，而不损害质量。可以从常规SpCas9基因（Addgene plasmid id = 47327）克隆Cas9En，并使用不属于该方案的标准实验室程序进行表达和纯化。类似地，可以使用来自模板基因（Addgene plasmid id = 51765）的体外转录实验室合成sgRNA，或者可以从各种来源购买。
一旦这些材料准备就绪，制作Cas9En-RNP复合物大约需要30分钟，并使得Cas9En-RNP /纳米纳米组件立即用于输送（图1）。完成交付（90-95％细胞质和核递送）在不到3小时内实现。后续编辑实验需要根据用户需要额外的时间。
报道了精氨酸功能化金纳米粒子（ArgNPs）（Yang等人，2011），重组Cas9En的表达和sgRNA的体外合成的合成（Mout ...
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