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Author:
Date:
2018-03-05
[Abstract] Arrays of short, singly-labeled ssDNA oligonucleotides enable in situ hybridization with single molecule sensitivity and efficient transcript specific RNA capture. Here, we describe a simple, enzymatic protocol that can be carried out using basic laboratory equipment to convert arrays of PCR oligos into smFISH and RAP probesets in a quantitative, cost-efficient and flexible way.
[摘要] 短的，单标记的ssDNA寡核苷酸阵列使得能够与单分子灵敏度和有效的转录物特异性RNA捕获进行原位杂交。 在这里，我们描述了一个简单的酶促协议，可以使用基本的实验室设备将PCR寡核苷酸阵列以定量，成本高效和灵活的方式转换为smFISH和RAP探针组。
【背景】合成来源的多个单标记的短寡核苷酸的使用极大地改进了对特异性转录物的高特异性和单分子灵敏度的检测（Femino等人，1998; Raj等人。，2008）。这种探针分子与经典使用的长核酸探针相比具有改进的穿透性并且需要更温和的杂交条件，从而更好地保存标本的结构（例如，Little等人 >，2015，Gaspar 等，2017a）。由于在该设计中多个寡核苷酸 - 通常24-96-靶向相同转录物的不同部分，因此在非特异性背景上在特异性靶分子上发生信号累积，这与由长的多标记探针产生的相等信号相反（Raj ，2008）。此外，由于单个短探针的标记是定量的 - 与长探针的随机标记相反 - ...
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Author:
Date:
2017-10-20
[Abstract] In this protocol, engineered Cas9-ribonucleoprotein (Cas9 protein and sgRNA, together called Cas9-RNP) and gold nanoparticles are used to make nanoassemblies that are employed to deliver Cas9-RNP into cell cytoplasm and nucleus. Cas9 protein is engineered with an N-terminus glutamic acid tag (E-tag or En, where n = the number of glutamic acid in an E-tag and usually n = 15 or 20), C-terminus nuclear localizing signal (NLS), and a C-terminus 6xHis-tag. [Cas9En hereafter]
To use this protocol, the first step is to generate the required materials (gold nanoparticles, recombinant Cas9En, and sgRNA). Laboratory-synthesis of gold nanoparticles can take up to a few weeks, but can be synthesized in large batches that can be used for many years without compromising the quality. Cas9En ...
[摘要] 在该方案中，使用工程化的Cas9-核糖核蛋白（Cas9蛋白和sgRNA，一起称为Cas9-RNP）和金纳米颗粒制备用于将Cas9-RNP递送至细胞质和细胞核的纳米组件。 Cas9蛋白用N末端谷氨酸标签（E标签或En，其中n = E-标签中的谷氨酸数目，通常n = 15或20），C末端核定位信号（NLS） ，和C末端6xHis标签。 [Cas9En]
为了使用该方案，第一步是产生所需的材料（金纳米颗粒，重组Cas9En和sgRNA）。金纳米颗粒的实验室合成可能需要长达数周，但可以批量合成，可以使用多年，而不损害质量。可以从常规SpCas9基因（Addgene plasmid id = 47327）克隆Cas9En，并使用不属于该方案的标准实验室程序进行表达和纯化。类似地，可以使用来自模板基因（Addgene plasmid id = 51765）的体外转录实验室合成sgRNA，或者可以从各种来源购买。
一旦这些材料准备就绪，制作Cas9En-RNP复合物大约需要30分钟，并使得Cas9En-RNP /纳米纳米组件立即用于输送（图1）。完成交付（90-95％细胞质和核递送）在不到3小时内实现。后续编辑实验需要根据用户需要额外的时间。
报道了精氨酸功能化金纳米粒子（ArgNPs）（Yang等人，2011），重组Cas9En的表达和sgRNA的体外合成的合成（Mout ...
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