Determination of Flavin Potential in Proteins by Xanthine/Xanthine Oxidase Method
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Author:
Date:
2020-04-05
[Abstract] This protocol describes a simple xanthine/xanthine oxidase enzymatic equilibration method for determination of the redox potential of a flavin. As an example of the use of this method, we determine the reduction potential of the covalently bound FAD cofactor (Em = -55 mV) in the SdhA flavoprotein subunit of succinate dehydrogenase from Escherichia coli. In principle, this method can be used routinely to determine the redox potential of flavin cofactors in any simple flavoprotein from equilibrium concentrations with an appropriate reference dye of known Em without the use of sophisticated electrochemical equipment.
[摘要] [摘要] 该协议描述了一种简单的黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶酶平衡方法,用于测定黄素的氧化还原电位。作为使用此方法的一个例子,我们确定了大肠杆菌中琥珀酸脱氢酶的SdhA 黄素亚基中共价结合的FAD辅因子的还原电位(E m = -55 mV)。原则上,该方法可常规用于通过平衡浓度和已知E m 的适当参考染料确定任何简单黄素蛋白中黄素辅因子的氧化还原电位。 无需使用复杂的电化学设备。
[背景] 几种生物物理方法可用于测量蛋白质中黄素的还原中点电位(E m )。这些电位测量方法通常依赖于目标蛋白质和电极之间的电化学偶联。例如,在带有其他辅助因子(例如铁硫中心和醌)的复杂黄素蛋白中,常常使用电化学方法和电子顺磁共振(EPR)光谱来确定氧化还原中心的E m (Kowal 等,1995;Saenger等,等人,2005; Hudson 等人,2005; Cheng 等人,2015)。然而,在只包含黄素氧化还原中心简单黄素蛋白,辅助因子,可以直接通过它不需要特殊的设备电化学或昂贵的EPR仪表传统光学分光光度法研究。1990年,文森特·梅西(Vincent Massey)提出了一种简单的方法,该方法可以从氧化和还原伴侣(即黄素蛋白和参考染料)的平衡浓度中确定黄素的还原电位(Massey,1991)。该方法不直接测量黄素的还原电势,而是确定黄素和参考染料的E m ...
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Crude Preparation of Lipopolysaccharide from Helicobacter pylori for Silver Staining and Western Blot
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Author:
Date:
2017-10-20
[Abstract] This protocol provides an easy and rapid method to prepare lipopolysaccharide from the gastric pathogen Helicobacter pylori for visualization on acrylamide gels by silver staining and for detecting the presence of Lewis antigens by Western blot. The silver staining is a four-step procedure, involving a 20 min-oxidation step, a 10 min-silver staining step, a 2-10 min color development step and finally a 1-min color termination step. Lipopolysaccharide from H. pylori wild-type and corresponding mutants analyzed by this method are described in a recent publication (Li et al., 2017). This crude preparation of LPS for silver staining is also applicable in other Gram-negative bacteria.
[摘要] 该方案提供了一种从胃病原幽门螺杆菌制备脂多糖的简便快速方法,用于通过银染显示丙烯酰胺凝胶,并通过Western印迹检测Lewis抗原的存在。 银染是四步法,包括20分钟氧化步骤,10分钟银染色步骤,2-10分钟显色步骤,最后是1分钟颜色终止步骤。 来自H的脂多糖。 在最近的出版物(Li等人,2017)中描述了通过该方法分析的野生型和相应的突变体的幽门螺杆菌。 这种用于银染的LPS的粗制剂也适用于其他革兰氏阴性细菌。 【背景】脂多糖(LPS)是一种大而可变的复合糖脂,其组成了大多数革兰氏阴性细菌外膜的外叶。 它通常由三个结构域组成:称为脂质A(或内毒素)的疏水结构域,其嵌入外膜中; 相对保守的非重复核 - 低聚糖; 和从细胞延伸到外部环境的可变O-抗原。 H的独特功能。 幽门螺杆菌脂多糖O抗原是模拟人Lewis抗原的岩藻糖基化寡糖结构的存在。 从革兰氏阴性细菌大规模提取高纯度的LPS是劳动密集型和耗时的。 在这里,在这个协议中,我们详细地描述了使用来自胃病原幽门螺杆菌的容易和快速的粗制备制剂用于通过银染和Lewis抗原通过蛋白质印迹进行表达。
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