| Bacterial Conjugation Protocol for Ruminant Mycoplasmas
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Author:
Date:
2021-01-20
[Abstract] In Mycoplasma agalactiae, two simultaneous processes of DNA transfer have been described that require direct cell-to-cell contact and are similar to conjugation. One involves the self-transmission of an integrative conjugative element (ICE) while the second concerns the horizontal transfer of large and small fragments of chromosomal DNA. Here, we describe an optimized conjugation protocol for the horizontal transfer of ICE or chromosomal DNA carrying antibiotic resistance markers (i.e., tetracycline, gentamicin, puromycin) from donor to recipient mycoplasma cells. Calculation of the conjugation frequencies, selection and characterization of transconjugants are detailed. This protocol has been developed with M. agalactiae but has been successfully used for M. bovis and can be adapted to ...
[摘要] [摘要]在无乳支原体中，已经描述了DNA转移的两个同时过程，它们需要直接的细胞间接触，并且类似于缀合。一种涉及整合共轭元件（ICE）的自我传递，而第二种涉及染色体DNA大小片段的水平转移。在这里，我们描述了一种优化的结合方案，用于从供体到受体支原体细胞水平转移带有抗生素抗性标记（即四环素，庆大霉素，嘌呤霉素）的ICE或染色体DNA 。详细介绍了共轭频率的计算，跨共轭物的选择和表征。该协议已与无乳分枝杆菌一起开发但已成功用于牛分枝杆菌，并可适应其他相关支原体物种。
[背景]共轭的，水平的DNA转移是微生物多样化的关键角色。通过促进细胞与细胞之间的紧密接触主动转移DNA （Lederberg和Tatum，1946），这种现象促进了从外部资源快速获取新性状。支原体（类柔膜）是无壁菌，其进化已经被认为是由基因损失仅减小驱动的基因组，并且其中水平基因转移（HGT ）被长期被认为是边缘。在过去的十年中，比较基因组学分析重新审视了这种范例，并显示出（i）在共享同一宿主的支原体物种之间发生了HGTs事件（Sirand-Pugnet et al。，2007），以及（ii）整合和共轭的存在元件（ICE中）中的大量测序支原体基因组（Calcutt等人，2002; Marenda等人，2006; Dordet-弗里索尼等人，2013;拖期等人，2015; Meygret ...
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| Transient Expression Assay in NahG Arabidopsis Plants Using Agrobacterium tumefaciens
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Author:
Date:
2018-06-20
[Abstract] Agrobacterium-mediated transient expression has greatly contributed to research in molecular plant biology but has low efficiency and inconsistency in Arabidopsis thaliana (Arabidopsis). Here, we describe a simple, efficient and fast protocol to make transient gene expression in NahG Arabidopsis plants using Agrobacterium tumefaciens. This protocol has been successfully used to assess protein sub-cellular localization and accumulation, enzyme activity, and protein-protein interaction. In addition, this assay overcomes the use of Nicotiana benthamiana plants as a surrogate system for transient gene expression assays. Finally, the use of this protocol does not require complex inoculation methods or specific growth conditions, and can be ...
[摘要] 农杆菌介导的瞬时表达大大促进了分子植物生物学的研究，但是在拟南芥（Arabidopsis thaliana）（ Arabidopsis ）中效率低且不一致。 在这里，我们描述了一种简单，高效和快速的方法，用于根据根癌农杆菌在 NahG 拟南芥植物中进行瞬时基因表达。 该方案已成功用于评估蛋白质亚细胞定位和积累，酶活性和蛋白质 - 蛋白质相互作用。 此外，该测定法克服了使用本氏烟草植物作为瞬时基因表达测定的替代系统。 最后，该方案的使用不需要复杂的接种方法或特定的生长条件，并且可以与具有相似结果的不同农杆菌菌株一起使用。
【背景】根癌土壤杆菌（以下简称土壤杆菌）介导的瞬时转化试验已经对分子植物生物学研究作出了重大贡献。这些方法与费时费力的稳定转化方法相比具有许多优点，其中包括在烟草本氏烟中进行瞬时转化测定时更高的效率，简单性和快速，一致的结果。另一方面，当在模式植物拟南芥（以下称为拟南芥）中进行这些测定时，这些测定是无效的并且缺乏稳健性，从而迫使拟南芥研究人员使用 N。本氏烟草作为一种异源系统，这会带来明显的局限性，并可能产生令人误解的结果。
过去已做出许多努力来提高土壤杆菌介导的拟南芥中的瞬时转化的功效（在Krenek等人的综述中，2015年）。 ...
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| Protocol for Construction of a Tunable CRISPR Interference (tCRISPRi) Strain for Escherichia coli
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Author:
Date:
2017-10-05
[Abstract] We present a protocol for construction of tunable CRISPR interference (tCRISPRi) strains for Escherichia coli. The tCRISPRi system alleviates most of the known problems of plasmid-based expression methods, and can be immediately used to construct libraries of sgRNAs that can complement the Keio collection by targeting both essential and nonessential genes. Most importantly from a practical perspective, construction of tCRISPRi to target a new gene requires only one-step oligo recombineering. Additional advantages of tCRISPRi over other existing CRISPRi methods include: (1) tCRISPRi shows significantly less than 10% leaky repression; (2) tCRISPRi uses a tunable arabinose operon promoter and modifications in transporter genes to allow a wide dynamic range with graded control by ...
[摘要] 我们提出了构建大肠杆菌可调CRISPR干扰（tCRISPRi）菌株的方案。 tCRISPRi系统缓解了基于质粒的表达方法的大多数已知问题，并且可以立即用于构建可通过靶向必需基因和非必需基因来补充Keio收集物的sgRNA的文库。 最重要的是从实践的角度来看，建立tCRISPRi来靶向一个新的基因只需要一步寡核苷酸重组。 tCRISPRi与其他现有CRISPRI方法的其他优点包括：（1）tCRISPRi显示低于10％的泄漏抑制; （2）tCRISPRi使用可调阿拉伯糖操纵子启动子和转运蛋白基因的修饰，以允许通过阿拉伯糖诱导剂分级控制的宽动态范围; （3）tCRISPRi是无质粒的，整个系统整合到染色体中; （4）tCRISPRi菌株显示出理想的生理特性。
【背景】已经开发了各种CRISPR干扰系统，用于从细菌到真核生物的生物体。对于正在考虑使用CRISPRi细菌的人员，我们提供了关于我们的tCRISPRi系统的以下背景资料（Li等等，2016）及其与其他CRISPRi系统的比较。
Morgan-Kiss 等人。 （2002）开发了基于质粒的剂量诱导型启动子pBAD。它们的系统允许来自pBAD启动子的蛋白质的可调节表达，取决于阿拉伯糖水平。阿拉伯糖转运蛋白基因和araFGH在菌株中是无活性的。他们的菌株也有两个拷贝的lacY ...
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