| Heterologous Expression and Purification of the CRISPR-Cas12a/Cpf1 Protein
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Author:
Date:
2018-05-05
[Abstract] This protocol provides step by step instructions (Figure 1) for heterologous expression of Francisella novicida Cas12a (previously known as Cpf1) in Escherichia coli. It additionally includes a protocol for high-purity purification and briefly describes how activity assays can be performed. These protocols can also be used for purification of other Cas12a homologs and the purified proteins can be used for subsequent genome editing experiments.
Figure 1. Timeline of activities for the heterologous expression and purification of Francisella novicida Cas12a (FnCas12a) from Escherichia coli
[摘要] 该协议提供了分步说明（图1），用于在大肠杆菌中异源表达新西兰弗朗西斯菌弗朗西丝菌Cas12a（以前称为Cpf1）。 它还包括一个高纯度纯化方案，并简要介绍如何进行活性测定。 这些方案也可以用于其他Cas12a同系物的纯化，并且纯化的蛋白质可以用于随后的基因组编辑实验。
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图1.从大肠杆菌 异源表达和纯化<弗朗西斯弗朗西丝菌 Cas12a（FnCas12a）的活动时间表
【背景】原核CRISPR-Cas免疫系统通过使用CRISPR RNA（crRNA）作为外源DNA或RNA的序列特异性靶向的指导来提供针对病毒和质粒的保护（van der Oost等人，2014; Marraffini ，2015）。 1类CRISPR-Cas系统（包含I型，III型和IV型）通常形成多亚基蛋白-cRNA效应复合物，而2类系统（包含II型，V型和VI型）依赖于单个crRNA-引导的效应物核酸酶用于目标干扰（Mohanraju et al。 2016年）。
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| Protein Expression and Purification of the Hsp90-Cdc37-Cdk4 Kinase Complex from Saccharomyces cerevisiae
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Author:
Date:
2017-10-05
[Abstract] Interactions between Hsp90, its co-chaperone Cdc37 and kinases have been biochemically studied for over three decades and have been shown to be functionally important in organisms from yeast to humans. However, formation of a stable complex for structural studies has been elusive. In this protocol we describe expression and purification of Hsp90-Cdc37-Cdk4 kinase protein complex from Saccharomyces cerevisiae utilizing the viral 2A sequences to titrate the three proteins at similar levels.
[摘要] Hsp90，其伴侣伴侣Cdc37和激酶之间的相互作用已经在三十多年的生物化学研究中被证明在酵母与人类的生物体内在功能上是重要的。 然而，形成一个稳定的结构研究复合物是难以捉摸的。 在该方案中，我们描述了利用病毒2A序列以相似水平滴定三种蛋白质的来自酿酒酵母的Hsp90-Cdc37-Cdk4激酶蛋白复合物的表达和纯化。
【背景】Hsp90分子伴侣与其客体激酶之间的稳定形成复合物已经被证明在体外是难治性的。以前的工作表明，Hsp90的共伴伴Cdc37与昆虫Sf9细胞中的客体激酶的过表达导致Sf9 Hsp90，外源Cdc37和外源激酶（Vaughan等人，2006）之间的稳定复合物。然而，昆虫细胞培养需要特殊的设备，比其他研究较好的表达系统（如细菌和酵母）要难以进行遗传操作，并且显着较慢地生长和克隆。上述蛋白质在E中的共表达。大肠杆菌不产生可溶性激酶/稳定复合物。我们认为，酿酒酵母将具有必要的机制来帮助折叠和促进复合物的形成，并试图通过共同表达这些蛋白质来产生人Hsp90β，人Cdc37和人Cdk4激酶之间的复合物， S上。酵母。为了获得三种蛋白质的化学计量表达，我们利用病毒2A肽，其允许三个蛋白质在一个mRNA上转录，随后在翻译阶段切割。该系统已被用于人类细胞系和兔网状细胞（Kim等人，2011; ...
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