| Transient Expression Assay in NahG Arabidopsis Plants Using Agrobacterium tumefaciens
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Author:
Date:
2018-06-20
[Abstract] Agrobacterium-mediated transient expression has greatly contributed to research in molecular plant biology but has low efficiency and inconsistency in Arabidopsis thaliana (Arabidopsis). Here, we describe a simple, efficient and fast protocol to make transient gene expression in NahG Arabidopsis plants using Agrobacterium tumefaciens. This protocol has been successfully used to assess protein sub-cellular localization and accumulation, enzyme activity, and protein-protein interaction. In addition, this assay overcomes the use of Nicotiana benthamiana plants as a surrogate system for transient gene expression assays. Finally, the use of this protocol does not require complex inoculation methods or specific growth conditions, and can be ...
[摘要] 农杆菌介导的瞬时表达大大促进了分子植物生物学的研究，但是在拟南芥（Arabidopsis thaliana）（ Arabidopsis ）中效率低且不一致。 在这里，我们描述了一种简单，高效和快速的方法，用于根据根癌农杆菌在 NahG 拟南芥植物中进行瞬时基因表达。 该方案已成功用于评估蛋白质亚细胞定位和积累，酶活性和蛋白质 - 蛋白质相互作用。 此外，该测定法克服了使用本氏烟草植物作为瞬时基因表达测定的替代系统。 最后，该方案的使用不需要复杂的接种方法或特定的生长条件，并且可以与具有相似结果的不同农杆菌菌株一起使用。
【背景】根癌土壤杆菌（以下简称土壤杆菌）介导的瞬时转化试验已经对分子植物生物学研究作出了重大贡献。这些方法与费时费力的稳定转化方法相比具有许多优点，其中包括在烟草本氏烟中进行瞬时转化测定时更高的效率，简单性和快速，一致的结果。另一方面，当在模式植物拟南芥（以下称为拟南芥）中进行这些测定时，这些测定是无效的并且缺乏稳健性，从而迫使拟南芥研究人员使用 N。本氏烟草作为一种异源系统，这会带来明显的局限性，并可能产生令人误解的结果。
过去已做出许多努力来提高土壤杆菌介导的拟南芥中的瞬时转化的功效（在Krenek等人的综述中，2015年）。 ...
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| Root Gall Formation, Resting Spore Isolation and High Molecular Weight DNA Extraction of Plasmodiophora brassicae
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Author:
Date:
2018-06-05
[Abstract] Isolation of DNA from obligate biotrophic soil-borne plant pathogens is challenging. This is because of their strict requirement of living plant tissue for their growth and propagation. A soil habitat further imposes risk of contamination from other microorganisms living in close vicinity of the plant roots. Here we present a protocol on how to prepare DNA suitable for advanced molecular analysis on the soil-borne pathogen Plasmodiophora brassicae, a peculiar unicellular plant pathogenic organism, causing disease on Crucifers. First, it is important to grow Brassica or Arabidopsis plants in infested soils below a temperature of 25 °C under moist conditions to promote root gall formation. Root galls should be harvested ahead of initiation of the decomposing ...
[摘要] 从专性营养型土壤植物病原体中分离DNA是具有挑战性的。这是因为他们对植物生长和繁殖的严格要求。土壤栖息地进一步增加了居住在植物根部附近的其他微生物污染的风险。在这里，我们提出了一个关于如何制备适用于土传病原体Plasmodiophora brassicae ，一种特殊的单细胞植物致病生物，导致十字花科病的DNA进行DNA分析的方案。首先，在潮湿条件下，在温度低于25°C的条件下，在感染的土壤中种植芸薹属植物或拟南芥属植物对于促进根gall形成是重要的。在分解过程开始之前，不应迟于接种拟南芥或芜菁植株后四或九周，收获根gall。数量减少的土壤生物的休息孢子通过匀浆gall组织的梯度离心获得。用70％酒精和一套不同的抗生素治疗可促进 P。芸苔纯度。基于CTAB的程序允许分离适合大规模平行测序分析的高质量DNA。
【背景】Plasmodiophora brassicae 是一种土壤传播的植物病原体，其在包括拟南芥属的十字花科家族中引起根虫（棒状杆菌）。根肿病对全世界油菜（油菜）和卷心菜的种植有重大影响。 P上。 brassicae 是指定给超级组Rhizaria的一种专性生物营养素（需要一种生长寄主），Rhizaria是研究最少的真核生物组之一（Sierra等人，2016; Sibbald和Archibald， 2017年）。系统发育上， ...
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| Method for Multiplexing CRISPR/Cas9 in Saccharomyces cerevisiae Using Artificial Target DNA Sequences
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Author:
Date:
2017-09-20
[Abstract] Genome manipulation has become more accessible given the advent of the CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) editing technology. The Cas9 endonuclease binds a single stranded (single guide) RNA (sgRNA) fragment that recruits the complex to a corresponding genomic target sequence where it induces a double stranded break. Eukaryotic repair systems allow for the introduction of exogenous DNA, repair of existing mutations, or deletion of endogenous gene products. Targeting of Cas9 to multiple genomic positions (termed ‘multiplexing’) is achieved by the expression of multiple sgRNAs within the same nucleus. However, an ongoing concern of the CRISPR field has been the accidental targeting of Cas9 to alternative (‘off-target’) DNA locations within a genome. We ...
[摘要] 鉴于CRISPR（集群定期间隔短回归重复）编辑技术的出现，基因组操纵变得更加易于使用。 Cas9核酸内切酶将募集复合物的单链（单向导）RNA（sgRNA）片段结合到相应的基因组靶序列，引发双链断裂。真核修复系统允许引入外源DNA，修复现有突变或内源基因产物的缺失。通过在同一核内表达多个sgRNA来实现Cas9对多个基因组位置的定位（称为“多重”）。然而，CRISPR领域的持续关注是将Cas9意外地定位到基因组内的替代（“脱靶”）DNA位置。我们将安装的人造Cas9靶序列的使用（称为人造基因座上的Cas9复制）描述为允许（i）与单个sgRNA复用的酵母基因组中的用途; （ii）减少/消除可能的脱靶效应，以及（iii）精确控制预定目标序列的放置。
【背景】CRISPR（集群定期间隔回归重复）机制已经在原核生物中演变为具有很高精度编辑任何基因组的能力的原始适应性免疫系统（Jinek等，2012; Sorek等，2013）。这种生物技术需要使用来自化脓性链球菌（或othologous物种）的内切核酸酶（Cas9），单个RNA'引导'序列和外源供体DNA（如果需要）。仅在短短几年内，CRISPR / ...
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