| Candida albicans Agar Invasion Assays
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Author:
Date:
2020-08-20
[Abstract] The ability of the human fungal pathogen Candida albicans to disseminate into tissues is promoted by a switch from budding to invasive hyphal growth. This morphological transition is stimulated by multiple environmental factors that can vary at different sites of infection. To identify genes that promote invasive growth, C. albicans mutants can be screened for defects in growing invasively into solid agar medium as a substitute for studying tissue invasion. This in vitro approach has advantages in that it permits the media conditions to be varied to mimic different host environments. In addition, the concentration of agar can be varied to determine the effects of altering the rigidity of the matrix into which the cells invade, as this provides a better indicator ...
[摘要] [摘要 ] 人类真菌病原体白色念珠菌传播到组织的能力是由从发芽到侵入性菌丝生长的转换而增强的。多种环境因素可能会刺激这种形态转变，这些环境因素可能在不同的感染部位有所不同。为了鉴定促进侵入growt基因小时，白色念珠菌突变体可以在侵入性生长成固体琼脂培养基作为研究组织侵袭的替代品进行筛选的缺陷。这个体外 该方法的优点在于，它允许改变媒体条件以模仿不同的主机环境。另外，可以改变琼脂的浓度以确定改变细胞侵袭的基质的刚度的作用，因为与液体培养中形成菌丝的能力相比，这提供了更好的侵袭性生长指标。在多种条件下的测试可以用来鉴定具有最强缺陷的突变细胞。因此，将描述用于分析白色念珠菌在不同条件下的侵袭性生长的方案和培养基，其适合于测试突变株白色念珠菌菌株的单个菌株或高通量分析。
[背景 ] 白色念珠菌是一种多形性真菌病原体，可以通过形成芽（小球形细胞），假菌丝细胞（细长细胞链）或菌丝细胞（具有平行平行线的长丝状细胞链）生长（图1）（贵族等人，2017）。已证明宿主中遇到的多种环境刺激可促进向侵袭性生长的转变，包括人体温度（37 °C ），碱性pH，CO 2 ，血清中的因子和糖GlcNAc（N-乙酰氨基葡萄糖） ）（Kornitzer，2019）。萌芽细胞被认为促进胃肠道的血流传播和定植（Pierce和Kumamoto ，2012 ；Witchley ...
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| NMR waterLOGSY as An Assay in Drug Development Programmes for Detecting Protein-Ligand Interactions–NMR waterLOGSY
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Author:
Date:
2020-07-05
[Abstract] In drug development programmes, multiple assays are needed for the determination of protein-compound interactions and evaluation of potential use in assays with protein-protein interactions. In this protocol we describe the waterLOGSY NMR method for confirming protein-ligand binding events.
[摘要] [摘要] 在药物开发计划中，需要多种测定方法来测定蛋白质与化合物的相互作用，并评估在蛋白质与蛋白质相互作用中的潜在用途。在此协议中，我们描述了用于确认蛋白质-配体结合事件的waterLOGSY NMR方法。
[背景] 随着在疾病细胞中发现更多的蛋白质形式变化，药物发现计划不断增加，这些计划依赖于使用小分子文库对目标蛋白质进行初步筛选，然后进行进一步的药物化学运动以增加所散发的化学物质的效力。从屏幕上。经过初步筛选后，出现了一系列正交分析，这些化学分析有助于验证命中的化学物质，并可以对化合物进行分层，以选择最佳化合物以进入命中领先阶段，进而进行前导优化。在这些测定法是基于NMR的水大号igand ö 经由bserved ģ radient 小号pectroscop ý （waterLOGSY ）方法（Dalvit 等人，2000和2001） 。waterLOGSY 是用于检测配体的结合是特别有用的互相作用相对弱与靶蛋白（即，在μM解离常数为低毫范围），如所预期的要与初始命中从一个大的化学或片段库相关联药物化学之前先进行筛分（Lepre，2011），以提高药效和类似药物的性能。
WaterLOGSY 如何工作
该waterLOGSY 方法利用1个小分子的1 H ...
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| Multiple Stepwise Gene Knockout Using CRISPR/Cas9 in Escherichia coli
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Author:
Date:
2018-01-20
[Abstract] With the recent implementation of the CRISPR/Cas9 technology as a standard tool for genome editing, laboratories all over the world are undergoing one of the biggest advancements in molecular biology since PCR. The key advantage of this method is its simplicity and universal applicability for species of any phylum. Of particular interest is the extensively studied Gram-negative bacterium Escherichia coli, as it is considered as the workhorse for both research and industrial purposes. Here, we present a simple, robust and effective protocol using the CRISPR/Cas9 system in combination with the λ Red machinery for gene knockout in E. coli. Crucial in our procedure is the use of a double-stranded donor DNA and a curing strategy for removal of the guide RNA encoding plasmid ...
[摘要] 随着CRISPR / Cas9技术作为基因组编辑的标准工具的最近实施，全世界的实验室正在经历PCR以来分子生物学方面最大的进步之一。这种方法的关键优点是其简单和普遍适用于任何物种的门。特别感兴趣的是广泛研究的革兰氏阴性细菌大肠杆菌，因为它被认为是研究和工业用途的主力。在这里，我们提出了一个简单，强大和有效的协议，使用CRISPR / Cas9系统结合λ红色基因敲除机器。大肠杆菌。在我们的程序中最重要的是使用双链供体DNA和固化策略来去除导向RNA编码质粒，其允许在仅仅两个工作日后开始新的突变。我们的方案允许多个具有高诱变效率的基因敲除株，适用于高通量的方法。
【背景】革兰氏阴性细菌大肠杆菌是生物技术工程中最重要的生物之一。已在能源，农业，食品生产，生物技术，医药等不同行业的各种流程中成功实施。由于不断的技术进步，生物技术部门正在迅速发展。特别是，CRISPR / Cas9技术可能是PCR（分子）生物学最大的革命（Ledford，2015）。简而言之，CRISPR / Cas9保护细菌免受诸如质粒和病毒等侵入性遗传因子的影响（Marraffini，2015）。利用这种从原核生物获得的免疫系统，已经开发了基于CRISPR / Cas9系统的基因组编辑的非常有力的工具（Jinek等人，2012）。
CRISPR / ...
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