| Uptake Assays to Monitor Anthracyclines Entry into Mammalian Cells
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Author:
Date:
2017-09-20
[Abstract] Anthracyclines, such as doxorubicin and daunorubicin, are DNA damaging agents that autofluoresce and can be readily detected in cells. Herein, we developed suitable assays to quantify and localize daunorubicin in mammalian cells. These assays can be exploited to identify components that are involved in the uptake of anthracyclines.
[摘要] 蒽环类药物，如多柔比星和柔红霉素，是DNA损伤剂，其可自发荧光并且可以容易地在细胞中检测到。 在这里，我们开发了合适的测定法来定量和定位哺乳动物细胞中的柔红霉素。 可以利用这些测定来鉴定参与蒽环类药物吸收的成分。
【背景】蒽环类药物，如多柔比星和柔红霉素，通过损伤DNA起作用，用于治疗各种类型的癌症，包括急性骨髓性白血病。当癌症患者被系统地给予蒽环类抗生素时，有几个因素限制了到达肿瘤部位的药物的量（Chauncey，2001; Deng等，2014; Riganti等，2015）。在肿瘤中，对癌细胞的药物活性受到药物吸收不良，药物流出过量以及细胞靶标变化的限制。几十年来，这些DNA损伤剂如何进入癌细胞还不清楚（Aouida等，2010; Cesar-Razquin等，2015; Zhang等，2015）。为了解决这个问题，我们开发了三种可靠的体外测定法来监测柔红霉素在细胞中的积累。这些测定中的两个是定量的，需要获得荧光活化细胞分选（FACS）口径和Fluoroskan仪器，第三个是使用落射荧光显微镜进行半定量。使用这些测定法，我们确定柔红霉素以时间和浓度依赖的方式进入细胞，并且每种细胞类型显示不同的摄取速率，这表明活性过程参与蒽环类药物的摄入（Andreev等人， ...
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| Cell-based Assays to Monitor AID Activity
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Author:
Date:
2016-02-05
[Abstract] The enzyme Activation induced deaminase (AID) underpins antibody affinity maturation and isotype switching through its mutagenic activity of deaminating deoxycytidine to deoxyuridine in DNA. Subsequent processing of the deoxyuridine initiates the processes of somatic hypermutation (SHM) and class switch recombination (CSR) in B cells. Structure-function analysis of AID requires sensitive and biologically relevant methods to measure its various activities. Here we describe simple but effective methods to measure 1) the ability of AID to mutate the Escherichia coli genome, which provides an indication of its catalytic activity; 2) the capacity of AID to perform SHM by complementing a derivative of the DT40 chicken B cell line; 3) the ability of AID to perform CSR by complementing ...
[摘要] 酶活化诱导的脱氨酶（AID）通过其将脱氧胞苷脱氨基到DNA中的脱氧尿苷的诱变活性来支持抗体亲和力成熟和同种型转换。脱氧尿苷的后续加工引发B细胞中体细胞超突变（SHM）和类型转换重组（CSR）的过程。 AID的结构功能分析需要灵敏和生物相关的方法来测量其各种活动。在这里我们描述简单但有效的方法来测量1）AID突变大肠杆菌基因组的能力，其提供其催化活性的指示; 2）AID通过补充DT40鸡B细胞系的衍生物来进行SHM的能力; 3）AID通过补充AID缺乏的原代小鼠B细胞来进行CSR的能力。三种方法的组合，伴随着AID亚细胞定位和蛋白质表达水平和稳定性的必要分析作为对照，允许AID的详细结构功能研究。
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