| Multiple Stepwise Gene Knockout Using CRISPR/Cas9 in Escherichia coli
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Author:
Date:
2018-01-20
[Abstract] With the recent implementation of the CRISPR/Cas9 technology as a standard tool for genome editing, laboratories all over the world are undergoing one of the biggest advancements in molecular biology since PCR. The key advantage of this method is its simplicity and universal applicability for species of any phylum. Of particular interest is the extensively studied Gram-negative bacterium Escherichia coli, as it is considered as the workhorse for both research and industrial purposes. Here, we present a simple, robust and effective protocol using the CRISPR/Cas9 system in combination with the λ Red machinery for gene knockout in E. coli. Crucial in our procedure is the use of a double-stranded donor DNA and a curing strategy for removal of the guide RNA encoding plasmid ...
[摘要] 随着CRISPR / Cas9技术作为基因组编辑的标准工具的最近实施，全世界的实验室正在经历PCR以来分子生物学方面最大的进步之一。这种方法的关键优点是其简单和普遍适用于任何物种的门。特别感兴趣的是广泛研究的革兰氏阴性细菌大肠杆菌，因为它被认为是研究和工业用途的主力。在这里，我们提出了一个简单，强大和有效的协议，使用CRISPR / Cas9系统结合λ红色基因敲除机器。大肠杆菌。在我们的程序中最重要的是使用双链供体DNA和固化策略来去除导向RNA编码质粒，其允许在仅仅两个工作日后开始新的突变。我们的方案允许多个具有高诱变效率的基因敲除株，适用于高通量的方法。
【背景】革兰氏阴性细菌大肠杆菌是生物技术工程中最重要的生物之一。已在能源，农业，食品生产，生物技术，医药等不同行业的各种流程中成功实施。由于不断的技术进步，生物技术部门正在迅速发展。特别是，CRISPR / Cas9技术可能是PCR（分子）生物学最大的革命（Ledford，2015）。简而言之，CRISPR / Cas9保护细菌免受诸如质粒和病毒等侵入性遗传因子的影响（Marraffini，2015）。利用这种从原核生物获得的免疫系统，已经开发了基于CRISPR / Cas9系统的基因组编辑的非常有力的工具（Jinek等人，2012）。
CRISPR / ...
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| Construction of a Single Transcriptional Unit for Expression of Cas9 and Single-guide RNAs for Genome Editing in Plants
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Author:
Date:
2017-09-05
[Abstract] The CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-associated protein9 (Cas9) is a simple and efficient tool for genome editing in many organisms including plant and crop species. The sgRNAs of the CRISPR/Cas9 system are typically expressed from RNA polymerase III promoters, such as U6 and U3. In many transformation events, more nucleotides will increase the difficulties in plasmid construction and the risk of wrong integration in genome such as base-pair or fragment missing (Gheysen et al., 1990). And also, in many organisms, Pol III promoters have not been well characterized, and heterologous Pol III promoters often perform poorly (Sun et al., 2015). Thus, we have developed a method using single transcriptional unit (STU) CRISPR-Cas9 system to drive ...
[摘要] 相关蛋白9（Cas9）的CRISPR（聚集的定期交织的短回文重复序列）是许多生物体（包括植物和作物物种）中基因组编辑的简单有效的工具。 CRISPR / Cas9系统的sgRNA通常由RNA聚合酶III启动子（如U6和U3）表达。 在许多转化事件中，更多的核苷酸将增加质粒构建中的困难和基因组错误整合的风险，如碱基对或片段缺失（Gheysen等，1990）。 而且，在许多生物体中，Pol III启动子没有得到很好的表征，异源Pol III启动子通常表现不佳（Sun等，2015）。 因此，我们开发了使用单转录单位（STU）CRISPR-Cas9系统来驱动来自单个RNA聚合酶II启动子的Cas9和sgRNA的表达以在植物中实现有效的基因组编辑的方法。
【背景】CRISPR-Cas9系统的sgRNA主要由小核RNA启动子如U6和U3促进。虽然在许多情况下已经进行了繁殖效率的测试，但也有一些局限性：（1）难以实现Cas9和sgRNA的协调和/或诱导表达; （2）操作多个sgRNA用于多重基因编辑可能是乏味的，需要多个Pol III启动子。传统的RNA聚合酶II启动子不能用于驱动sgRNA表达，通过RNA聚合酶II将多余的核苷酸加入到gRNA的5'和3'末端，并可能中断正常的gRNA功能。另外，由RNA聚合酶II转录的RNA被快速输出到细胞质中，而CRISPR-Cas9 / ...
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