| Cell-free Generation of COPII-coated Procollagen I Carriers
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Author:
Date:
2017-11-20
[Abstract] The aim of this protocol is to generate COPII-coated procollagen I (PC1) carriers in a cell-free reaction. The COPII-coated PC1 carriers were reconstituted from donor membrane, cytosol, purified recombinant COPII proteins, and nucleotides. This protocol describes the preparation of donor membrane and cytosol, the assembly of the reaction, and the isolation and detection of reconstituted COPII-coated carriers. This cell-free reaction can be used to test conditions that stimulate or suppress the packaging of PC1 into COPII-coated carriers.
[摘要] 该协议的目的是在无细胞反应中产生COPII包被的前胶原I（PC1）载体。 COPII包被的PC1载体由供体膜，胞质溶胶，纯化的重组COPII蛋白和核苷酸重构。 该方案描述了供体膜和细胞溶胶的制备，反应的组装，以及复制的COPII包被的载体的分离和检测。 该无细胞反应可用于测试刺激或抑制PC1包装成COPII包被的载体的条件。
【背景】外壳蛋白复合体II（COPII）在从内质网（ER）途径到高尔基体的运输中起着至关重要的作用。来自ER的货物运输所需的基因在酵母的基因研究中被发现，并且借助于添加有纯化组分的无细胞囊泡萌芽反应来阐明囊泡出芽所需基因的蛋白质产物的精确作用（Novick 1981; Kaiser等人，1990; Barlowe等人，1994）。开发了类似的反应来检测COPII在培养的哺乳动物细胞中来自ER的货物运输中的作用（Kim等人，2005）。哺乳动物COPII包被的囊泡直径大约为80-100nm，似乎太小以至于不能容纳诸如刚性的300nm前胶原I（PC1）三股螺旋杆的大分泌性货物。尽管可能的尺寸差异，COPII对于包括PC1在内的大型货物的分泌是必不可少的（Boyadjiev等人，2006）。最近，我们报道了通过随机光学重建显微镜（STORM），相关光电子显微镜（CLEM）和活细胞成像（Gorur ...
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| Extraction and Molybdenum Blue-based Quantification of Total Phosphate and Polyphosphate in Parachlorella
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Author:
Date:
2017-09-05
[Abstract] Inorganic phosphorus is a non-renewable resource and an essential element for life on Earth. Organisms such as algae, protists, and animals can store phosphate (Pi) through uptake of Pi as polyphosphate (poly-P), which is a linear polymer of orthophosphate residues linked by high-energy phosphoanhydride bonds. Here, we describe procedures for extraction of total phosphate and poly-P from Parachlorella cells and quantification of orthophosphate based on molybdenum blue assay. The present method may be applicable for other microalgae.
[摘要] 无机磷是一种不可再生资源，是地球上生命的基本要素。 诸如藻类，原生生物和动物之类的生物体可以通过摄取作为多磷酸（poly-P）的Pi来储存磷酸盐（poly-P），聚磷酸盐是通过高能量磷酸酐键连接的正磷酸盐残基的线性聚合物。 在这里，我们描述了从Parachlorella细胞中提取总磷酸盐和poly-P以及基于钼蓝测定定量正磷酸盐的方法。 本方法可适用于其他微藻类。
【背景】生物磷回收是一种特别有吸引力的营养物回收形式。 藻类可以积聚磷酸盐（Pi），并且富含Pi的藻类生物质可用作生物肥料（Solovchenko等，2016）。 在以前的研究中，Ota等人 （2016）揭示了Parachlorella kessleri中硫缺乏（-S）条件下的电子密实体与聚P动力学的关系。 伞藻属于Trebouxiophyceae属的绿藻属，其特征在于刚性细胞壁和无性，不运动的生命周期。 这里提出的方案允许从小球藻提取总Pi和多磷酸（poly-P），并且基于钼蓝反应定量无机磷，这是用于定量正磷酸盐的标准方法。 Nagul等人先前回顾了钼蓝反应的理论背景。（2015年）。
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