| Investigating Localization of Chimeric Transporter Proteins within Chloroplasts of Arabidopsis thaliana
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Author:
Date:
2018-02-05
[Abstract] In this protocol, we describe a method to design chimeric proteins for specific targeting to the inner envelope membrane (IEM) of Arabidopsis chloroplasts and the confirmation of their localization by biochemical analysis. Specific targeting to the chloroplast IEM can be achieved by fusing the protein of interest with a transit peptide and an IEM targeting signal. This protocol makes it possible to investigate the localization of chimeric proteins in chloroplasts using a small number of transgenic plants by using a modified method of chloroplast isolation and fractionation. IEM localization of chimeric proteins can be further assessed by trypsin digestion and alkaline extraction. Here, the localization of the chimeric bicarbonate transporter, designated as SbtAII, is detected by ...
[摘要] 在这个协议中，我们描述了一种设计嵌合蛋白的方法，用于特异性靶向拟南芥叶绿体的内包膜（IEM）并通过生化分析确定它们的定位。 叶绿体IEM的特异性靶向可通过将感兴趣的蛋白质与转运肽和IEM靶向信号融合来实现。 这个协议使得有可能使用少量的转基因植物，通过使用修改的叶绿体分离和分离方法来研究嵌合蛋白在叶绿体中的定位。 嵌合蛋白的IEM定位可以通过胰蛋白酶消化和碱性提取进一步评估。 在此，称为SbtAII的嵌合碳酸氢根转运蛋白的定位通过使用针对葡萄球菌蛋白A的抗体进行蛋白质印迹来检测。该方案改编自上原等人，2016年
【背景】有人提出将蓝藻CO 2浓度机制整合到叶绿体中是改善C 3+植物光合作用的有希望的方法。 根据理论估计，将BicA和SbtA整合到叶绿体IEM中可以提高光合CO 2固定率。 我们研究了核编码的蓝细菌碳酸氢盐转运蛋白BicA和SbtA与拟南芥叶绿体的IEM的整合。 因此，我们制定了一个协议，设计嵌合构造为特定目标的IEM和调查嵌合蛋白在叶绿体中的定位。
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| Expression and Purification of a Mammalian P2X7 Receptor from Sf9 Insect Cells
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Author:
Date:
2017-09-05
[Abstract] The P2X7 receptor is an extracellular ATP-gated ion channel found only in eukaryotes (Bartlett et al., 2014). Due to its unique properties among P2X receptors, such as formation of a large conductance pore, the P2X7 receptor has been implicated in devastating diseases like chronic pain (North and Jarvis, 2013). However, mechanisms underlying the P2X7 specific properties remain poorly understood, partly because purification of this eukaryotic membrane protein has been challenging. Here we describe a detailed protocol for expressing and purifying a mammalian P2X7 receptor using an insect cell-baculovirus system. The P2X7 receptor is expressed in Sf9 insect cells as a GFP fusion protein and solubilized with a buffer containing Triton X-100 detergent. The P2X7-GFP fusion protein is ...
[摘要] P2X7受体是仅在真核生物中发现的胞外ATP门控离子通道（Bartlett等，2014）。由于其P2X受体之间的独特性质，例如大电导孔的形成，P2X7受体已经涉及破坏性疾病如慢性疼痛（North和Jarvis，2013）。然而，P2X7特异性属性的机制仍然知之甚少，部分原因是纯化这种真核膜蛋白是一个挑战。在这里，我们描述了使用昆虫细胞 - 杆状病毒系统表达和纯化哺乳动物P2X7受体的详细方案。 P2X7受体在作为GFP融合蛋白的Sf9昆虫细胞中表达，并用含有Triton X-100洗涤剂的缓冲液溶解。然后使用Strep-Tactin亲和层析在含有十二烷基麦芽糖苷的缓冲液中纯化P2X7-GFP融合蛋白。在通过凝血酶酶切割连接的GFP和Strep-标签后，使用大小排阻色谱分离P2X7受体。该方法通常从6L的Sf9培养物产生约2mg的纯化蛋白质。纯化的蛋白质可以用含有15％甘油的缓冲液在4℃下储存至少2个月，并用于各种功能和结构研究（Karasawa和Kawate，2016）。
【背景】P2X7受体是嘌呤能P2X受体家族的七种亚型之一，并且是广泛疾病如神经退行性疾病，癫痫和神经性疼痛的有希望的新型药物靶点（North和Jarvis，2013; Bhattacharya和Biber， ...
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