| Quantification of Trypanosoma cruzi in Tissue and Trypanosoma cruzi Killing Assay
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Author:
Date:
2017-11-20
[Abstract] Infection with Trypanosoma cruzi causes Chagas disease. The methods provided here allow for the quantification of T. cruzi in the liver, heart, and blood of intraperitoneally-infected mice and analysis of the killing activity of the cells infected with T. cruzi in vitro.
[摘要] 感染克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）引起恰加斯病（Chagas disease）。 这里提供的方法允许量化T。 克氏锥虫在感染腹腔的小鼠的肝脏，心脏和血液中分析，并分析克氏锥虫在体外感染的细胞的杀伤活性。
【背景】以慢性心肌病为特征的恰加斯病是由细胞内原生动物寄生虫克氏锥虫感染引起的（Bonney等人，2015年）。拉丁美洲大约有2000万人患有南美锥虫病（里贝罗等人，2012; Flavia Nardy等人，2015），已成为全球性的健康问题由于感染者的迁移（Andrade等人，2014; Garcia等人，2015; Requena-Mendez等人）， 2015年）。已经开发了几种药物，如nifurtimox和benznidazole，用于治疗恰加斯病。然而，这些药物需要服用数月，并有严重的副作用（Viotti et al。，2009）。治疗的主要目的是抑制T。克鲁兹通过血液传播以及防止心力衰竭的发展。因此，定量T的协议。 cruzi 和 T。这里介绍的克鲁兹杀螨试验可能有助于发展南美锥虫病的新型诊断方法和治疗策略。
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| Targeted Nucleotide Substitution in Mammalian Cell by Target-AID
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Author:
Date:
2017-06-05
[Abstract] Programmable RNA-guided nucleases based on CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated protein) systems have been applied to various type of cells as powerful genome editing tools. By using activation-induced cytidine deaminase (AID) in place of the nuclease activity of the CRISPR/Cas9 system, we have developed a genome editing tool for targeted nucleotide substitution (C to T or G to A) without donor DNA template (Figure 1; Nishida et al., 2016). Here we describe the detailed method for Target-AID to perform programmable point mutagenesis in the genome of mammalian cells. A specific method for targeting the hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HPRT) gene in Chinese Hamster Ovary (CHO) cell was described here as an ...
[摘要] 基于CRISPR的可编程RNA引导核酸酶（集群定期交织的短回文重复）-Cas（CRISPR相关蛋白）系统已被应用于各种类型的细胞作为强大的基因组编辑工具。通过使用激活诱导的胞苷脱氨酶（AID）代替CRISPR / Cas9系统的核酸酶活性，我们开发了一种用于靶向核苷酸替代（C至T或G至A）的基因组编辑工具，无供体DNA模板（图1 ; Nishida等人，2016）。这里我们描述Target-AID在哺乳动物细胞基因组中进行可编程点突变的详细方法。在这里描述了用于靶向中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中的次黄嘌呤 - 鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶（HPRT）基因的具体方法作为实例，而该方法主要应适用于任何感兴趣的基因广泛的细胞类型。
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图1. Target-AID及其可靶向位点的示意图。在指导RNA（gRNA）依赖性方式中，通过接头与nCas9（D10A）融合的PmCDA1在-21周围进行可编程胞苷突变至相对于哺乳动物细胞中非互补链上的PAM序列的-16位。可目标地点是根据以前的工作中观察到的有效的基础替代（> 20％）来确定的。
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| Identification of RNA-binding Proteins
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Author:
Date:
2016-09-05
[Abstract] This protocol describes the extraction of RNA-binding proteins (RBPs) from cell lysates. In order to pull down target RBPs, 5-bromo-UTP (BrUTP)-incorporated RNA probes are used, which are generated by in vitro transcription. The schematic diagram (Flowchart) with procedure is indicated (Figure1 and Figure 2).
Figure 1. Schematic diagram of procedure (A-H). Flow chart of experimental procedure is indicated at A-H.
图1.程序示意图（AH）。实验程序的流程图在AH指示。
图2.质粒的线性化 限制性酶。在与其克隆元件相邻的限制性位点切割质粒。
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