| Protein Expression and Purification of the Hsp90-Cdc37-Cdk4 Kinase Complex from Saccharomyces cerevisiae
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Author:
Date:
2017-10-05
[Abstract] Interactions between Hsp90, its co-chaperone Cdc37 and kinases have been biochemically studied for over three decades and have been shown to be functionally important in organisms from yeast to humans. However, formation of a stable complex for structural studies has been elusive. In this protocol we describe expression and purification of Hsp90-Cdc37-Cdk4 kinase protein complex from Saccharomyces cerevisiae utilizing the viral 2A sequences to titrate the three proteins at similar levels.
[摘要] Hsp90，其伴侣伴侣Cdc37和激酶之间的相互作用已经在三十多年的生物化学研究中被证明在酵母与人类的生物体内在功能上是重要的。 然而，形成一个稳定的结构研究复合物是难以捉摸的。 在该方案中，我们描述了利用病毒2A序列以相似水平滴定三种蛋白质的来自酿酒酵母的Hsp90-Cdc37-Cdk4激酶蛋白复合物的表达和纯化。
【背景】Hsp90分子伴侣与其客体激酶之间的稳定形成复合物已经被证明在体外是难治性的。以前的工作表明，Hsp90的共伴伴Cdc37与昆虫Sf9细胞中的客体激酶的过表达导致Sf9 Hsp90，外源Cdc37和外源激酶（Vaughan等人，2006）之间的稳定复合物。然而，昆虫细胞培养需要特殊的设备，比其他研究较好的表达系统（如细菌和酵母）要难以进行遗传操作，并且显着较慢地生长和克隆。上述蛋白质在E中的共表达。大肠杆菌不产生可溶性激酶/稳定复合物。我们认为，酿酒酵母将具有必要的机制来帮助折叠和促进复合物的形成，并试图通过共同表达这些蛋白质来产生人Hsp90β，人Cdc37和人Cdk4激酶之间的复合物， S上。酵母。为了获得三种蛋白质的化学计量表达，我们利用病毒2A肽，其允许三个蛋白质在一个mRNA上转录，随后在翻译阶段切割。该系统已被用于人类细胞系和兔网状细胞（Kim等人，2011; ...
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| Isolation and Quantification of Plant Extracellular Vesicles
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Author:
Date:
2017-09-05
[Abstract] Extracellular vesicles (EVs) play an important role in intercellular communication by transporting proteins and RNA. While plant cells secrete EVs, they have only recently been isolated and questions regarding their biogenesis, release, uptake and function remain unanswered. Here, we present a detailed protocol for isolating EVs from the apoplastic wash of Arabidopsis thaliana leaves. The isolated EVs can be quantified using a fluorometric dye to assess total membrane content.
[摘要] 细胞外囊泡（EVs）通过传递蛋白质和RNA在细胞间通讯中发挥重要作用。 虽然植物细胞分泌电动汽车，但是它们最近才被孤立，并且关于它们的生物发生，释放，摄取和功能的问题仍然没有得到回答。 在这里，我们提出了一个详细的方案，用于从拟南芥叶片的脱水洗涤中分离EV。 可以使用荧光染料定量分离的EV，以评估总膜含量。
【背景】细胞外囊泡（EVs）是介导蛋白质，脂质和遗传物质的细胞与细胞转移的膜结合结构。由于哺乳动物EVs转运RNA和调节免疫反应的能力，对哺乳动物EV的兴趣已经增长。哺乳动物EV通常被分离用于从培养细胞的培养基中研究，以及生物流体的增长列表（Colombo等，2014）。植物电动车也被认为在免疫反应中起作用，但比较缺乏（An et al。，2007; Davis et al。，2016）。这在很大程度上归因于没有孤立的方法。
虽然植物EVs自1967年以来一直被观察到，使用透射电子显微镜，但直到2009年才开发出分离方法（Halperin和Jensen，1967）。 ...
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