| A Novel Method to Construct Binary CRISPR Vectors for Plant Transformation by Single Round of PCR Amplification
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Author:
Date:
2021-04-05
[Abstract] CRISPR/Cas9 is an established and flexible tool for genome editing. However, most methods used to generate expression clones for the CRISPR/Cas9 are time-consuming. Hence, we have developed a one-step protocol to introduce sgRNA expression cassette(s) directly into binary vectors (Liu et al., 2020). In this approach, we have optimized the multiplex PCR to produce an overlapping PCR product in a single reaction to generate the sgRNA expression cassette. We also amplified two sgRNA expression cassettes through a single round of PCR. Then, the sgRNA expression cassette(s) is cloned into the binary vectors in a Gateway LR or Golden gate reaction. The system reported here provides a much more efficient and simpler procedure to construct expression clones for CRISPR/Cas9-mediated genome ...
[摘要] [摘要] CRISPR / Cas9是一种成熟且灵活的基因组编辑工具。但是，大多数用于生成CRISPR / Cas9表达克隆的方法都很耗时。因此，我们开发了一种将sgRNA表达盒直接引入二元载体的一步协议（Liu等人，2020年）。在这种方法中，我们优化了多重PCR，以在单个反应中产生重叠的PCR产物，从而生成sgRNA表达盒。我们还通过单轮PCR扩增了两个sgRNA表达盒。然后，在Gateway LR或Golden gate反应中将sgRNA表达盒克隆到二元载体中。本文报道的系统为构建用于CRISPR / Cas9介导的基因组编辑的表达克隆提供了更有效，更简单的程序。在此协议中，我们描述了使用此系统的详细分步说明。
[背景]乙acteria保卫针对病毒通过蛋白系统，由群集规则间隔开的短回文重复序列（CRISPR）中，CRISPR相关（CAS）蛋白质，CRISPR的RNA（crRNAs）和反式编码crRNA（tracrRNA）。现在，研究人员已经将其系统开发为用于靶向基因组编辑的关键工具。CRISPR –二元载体表达两个元素–具有靶序列的sgRNA（target-sgRNA）和Cas9蛋白–切割靶基因组区域。冯等人。（2013年）已经构建了网关载体，通过农杆菌介导的转化在植物中共表达Cas9和sgRNA ...
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| CRISPR/Cas9-mediated ssDNA Recombineering in Corynebacterium glutamicum
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2018-10-05
[Abstract] Corynebacterium glutamicum is a versatile workhorse for industrial bioproduction of many kinds of chemicals and fuels, notably amino acids. Development of advanced genetic engineering tools is urgently demanded for systems metabolic engineering of C. glutamicum. Recently unveiled clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) and their CRISPR-associated proteins (Cas) are now revolutionizing genome editing. The CRISPR/Cas9 system from Streptococcus pyogenes that utilizes NGG as protospacer adjacent motif (PAM) and has good targeting specificity can be developed into a powerful tool for efficient and precise genome editing of C. glutamicum. In this protocol, we described the general procedure for CRISPR/Cas9-mediated ssDNA ...
[摘要] 谷氨酸棒杆菌是多种化学品和燃料，特别是氨基酸的工业生物生产的多功能工具。 迫切需要开发先进的基因工程工具用于 C的系统代谢工程。谷氨酸。 最近推出的聚集的有规律的间隔短回文重复序列（CRISPR）和它们的CRISPR相关蛋白（Cas）现在正在彻底改变基因组编辑。 来自 Streptococcus pyogenes 的CRISPR / Cas9系统利用NGG作为原型间隔区相邻基序（PAM）并具有良好的靶向特异性，可以开发成为 C的高效和精确基因组编辑的有力工具。谷氨酸。 在该方案中，我们描述了 C中CRISPR / Cas9介导的ssDNA重组工程的一般程序。谷氨酸。 可以在 C中引入小的修改。 谷氨酸染色体，编辑效率高达90％。
【背景】革兰氏阳性土壤细菌 Corynebacterium glutamicum 是用于氨基酸，生物燃料和聚合物构建模块的工业生物生产的多功能工具（Becker et al。，2016）。在 C工程的早期阶段。谷氨酸，随机诱变结合对氨基酸类似物的表型抗性的阳性选择是最常用的策略（Vertes et al。，2005）。 C中的遗传操作。谷氨酸（glutamicum）于1984年启动，并成为菌株改良的关键促成策略（Ozaki et al。，1984）。常规使用的基因破坏和插入 ...
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| Construction of a Single Transcriptional Unit for Expression of Cas9 and Single-guide RNAs for Genome Editing in Plants
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2017-09-05
[Abstract] The CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-associated protein9 (Cas9) is a simple and efficient tool for genome editing in many organisms including plant and crop species. The sgRNAs of the CRISPR/Cas9 system are typically expressed from RNA polymerase III promoters, such as U6 and U3. In many transformation events, more nucleotides will increase the difficulties in plasmid construction and the risk of wrong integration in genome such as base-pair or fragment missing (Gheysen et al., 1990). And also, in many organisms, Pol III promoters have not been well characterized, and heterologous Pol III promoters often perform poorly (Sun et al., 2015). Thus, we have developed a method using single transcriptional unit (STU) CRISPR-Cas9 system to drive ...
[摘要] 相关蛋白9（Cas9）的CRISPR（聚集的定期交织的短回文重复序列）是许多生物体（包括植物和作物物种）中基因组编辑的简单有效的工具。 CRISPR / Cas9系统的sgRNA通常由RNA聚合酶III启动子（如U6和U3）表达。 在许多转化事件中，更多的核苷酸将增加质粒构建中的困难和基因组错误整合的风险，如碱基对或片段缺失（Gheysen等，1990）。 而且，在许多生物体中，Pol III启动子没有得到很好的表征，异源Pol III启动子通常表现不佳（Sun等，2015）。 因此，我们开发了使用单转录单位（STU）CRISPR-Cas9系统来驱动来自单个RNA聚合酶II启动子的Cas9和sgRNA的表达以在植物中实现有效的基因组编辑的方法。
【背景】CRISPR-Cas9系统的sgRNA主要由小核RNA启动子如U6和U3促进。虽然在许多情况下已经进行了繁殖效率的测试，但也有一些局限性：（1）难以实现Cas9和sgRNA的协调和/或诱导表达; （2）操作多个sgRNA用于多重基因编辑可能是乏味的，需要多个Pol III启动子。传统的RNA聚合酶II启动子不能用于驱动sgRNA表达，通过RNA聚合酶II将多余的核苷酸加入到gRNA的5'和3'末端，并可能中断正常的gRNA功能。另外，由RNA聚合酶II转录的RNA被快速输出到细胞质中，而CRISPR-Cas9 / ...
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