| Quantification of Colibactin-associated Genotoxicity in HeLa Cells by In Cell Western (ICW) Using γ-H2AX as a Marker
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Author:
Date:
2018-03-20
[Abstract] The genotoxin colibactin is produced by several species of Enterobacteriaceae. This genotoxin induces DNA damage, cell cycle arrest, senescence and death in eukaryotic cells (Nougayrède et al., 2006; Taieb et al., 2016). Here we describe a method to quantify the genotoxicity of bacteria producing colibactin following a short infection of cultured mammalian cells with colibactin producing E. coli.
[摘要] 基因毒素colibactin由几种肠杆菌科产生。 该基因毒素在真核细胞中诱导DNA损伤，细胞周期停滞，衰老和死亡（Nougayrède等人，2006; Taieb等人，2016）。 在这里，我们描述了一种方法来量化生产colibactin的细菌的基因毒性，在短时间感染培养的哺乳动物细胞后，产生e colibactin。大肠杆菌。
【背景】基因毒素colibactin是由几种肠杆菌科产生的聚酮化合物非核糖体肽杂交化合物。由编码在54kb基因组基因座pks岛上的机器合成的这种毒素在真核细胞中诱导DNA损伤，细胞周期停滞，衰老和死亡（Nougayrède等人， 2006年; Taieb 等人，2016年）。大肠杆菌素的基因毒性活性取决于直接的宿主细胞 - 细菌相互作用，并且不能从培养物上清液，杀死的细菌或细菌裂解物而非生命细菌重演。可以通过量化巨细胞病表型（对于方案参见Bossuet-Greif等人，2017）或双链DNA断裂的定量来评估对真核细胞的大肠杆菌素基因毒性效应的可视化和定量在彗星试验（揭示DNA片段化）或H2AX组蛋白磷酸化作用宿主细胞核中，双链DNA标记断裂。组蛋白H2AX的磷酸化表征为对遗传毒性剂的早期和敏感反应（Audebert等人，2010）。证明H2AX磷酸化比彗星试验在体外以及体内灵敏度高10-100倍（Audebert等人， ...
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| Stationary-phase Mutagenesis Soft-agar Overlay Assays in Bacillus subtilis
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Author:
Date:
2017-12-05
[Abstract] Elucidating how a population of non-growing bacteria generates mutations improves our understanding of phenomena like antibiotic resistance, bacterial pathogenesis, genetic diversity and evolution. To evaluate mutations that occur in nutritionally stressed non-growing bacteria, we have employed the strain B. subtilis YB955, which measures the reversions rates to the chromosomal auxotrophies hisC952, metB5 and leuC427 (Sung and Yasbin, 2002). This gain-of-function system has successfully allowed establishing the role played by repair systems and transcriptional factors in stress-associated mutagenesis (SPM) (Barajas-Ornelas et al., 2014; Gómez-Marroquín et al., 2016). In a recent study (Castro-Cerritos et al., 2017), it was ...
[摘要] 阐明非增长细菌群体如何产生突变提高了我们对诸如抗生素抗性，细菌发病机理，遗传多样性和进化等现象的理解。为了评估在营养强调的非生长细菌中发生的突变，我们使用了菌株B。它们测量对染色体营养缺陷型hisC952，metB5和leuC427（Sung和Yasbin，2002）的逆转速率。这种功能获得性系统已成功地允许建立修复系统和转录因子在压力相关的诱变（SPM）中所起的作用（Barajas-Ornelas等人，2014;Gómez-Marroquín等。，2016）。在最近的研究（Castro-Cerritos等人，2017）中，发现核糖核苷酸还原酶（RNR）是SPM所必需的;这种酶在这种细菌中是必不可少的。我们设计了菌株B的条件性突变体。其中通过异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）（Castro-Cerritos等人，2017）调控了nrdEF操纵子的表达， 。确定在该条件突变体中在营养胁迫下确定三个基因（hisC952，metB5，leuC427）中的氨基酸原养型的突变频率的条件详细这里。这种技术可以用来评估重要基因在应激B发生的致突变过程中的参与。枯草杆菌细胞。
【背景】涉及DNA复制的大约270个基因，包括dnaA，dnaB，dnaC和nrdEF操纵子，它编码RNR，被认为是必不可少的。枯草芽孢杆菌生长（Kobayashi等人，2003）。在这里我们描述了一个协议，已被用来了解这种酶的作用调节事件诱变事件营养应激的非生长细菌菌株枯草芽孢杆菌YB955（emC952，emCecuC427， ...
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| Protocol for HeLa Cells Infection with Escherichia coli Strains Producing Colibactin and Quantification of the Induced DNA-damage
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2017-08-20
[Abstract] Strains of Escherichia coli bearing the pks genomic island synthesize the genotoxin colibactin. Exposure of eukaryotic cells to E. coli producing colibactin induces DNA damages, ultimately leading to cell cycle arrest, senescence and death. Here we describe a simple method to demonstrate the genotoxicity of bacteria producing colibactin following a short infection of cultured mammalian cells with pks+ E. coli.
[摘要] 具有pks基因组岛的大肠杆菌菌株合成基因毒素大肠杆菌素。 将真核细胞暴露于产生大肠杆菌的大肠杆菌诱导DNA损伤，最终导致细胞周期停滞，衰老和死亡。 在这里，我们描述了一种简单的方法来证明在用pks +大肠杆菌培养的哺乳动物细胞的短时间感染后，产生大肠杆菌素的细菌的遗传毒性。
【背景】大肠杆菌素是在大肠杆菌的肠外致病，共生和益生菌菌株中发现的基因毒素（Nougayrede等，2006）。大肠杆菌素也由其他肠杆菌科产生，包括肺炎克雷伯杆菌，产气肠杆菌和柠檬酸杆菌（Putze等人，2009）。大肠杆菌素是通过由多酮酶和非核糖体肽合酶（PKS和NRPS），定制和成熟酶以及外排泵组成的多酶机械合成的聚酮化合物/非核糖体肽杂化化合物（综述：Taieb等人。，2016）。该合成机制编码在52kb的基因组，即'pks'岛上。 Colibactin在感染pks +细菌的真核细胞中诱导DNA损伤。由大肠杆菌素诱导的遗传毒性作用需要活的pks +细菌与真核细胞的直接接触。事实上，杀死的细菌或细菌上清液或裂解物没有观察到遗传毒性作用。因此，为了证明产生大肠杆菌的大肠杆菌的基因毒性，培养的哺乳动物细胞（例如HeLa细胞）在4小时内用活的pks ...
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