| Coupling Exonuclease Digestion with Selective Chemical Labeling for Base-resolution Mapping of 5-Hydroxymethylcytosine in Genomic DNA
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Author:
Date:
2018-03-05
[Abstract] This protocol is designed to obtain base-resolution information on the level of 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) in CpGs without the need for bisulfite modification. It relies on (i) the capture of hydroxymethylated sequences by a procedure known as ‘selective chemical labeling’ (see Szulwach et al., 2012) and (ii) the digestion of the captured DNA by exonucleases. After Illumina sequencing of the digested DNA fragments, an ad hoc bioinformatic pipeline extracts the information for further downstream analysis.
[摘要] 该协议旨在获得CpGs中5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）水平的碱基分辨率信息，而无需亚硫酸氢盐修饰。 它依赖于（i）通过称为“选择性化学标记”（参见Szulwach等人，2012）的方法捕获羟甲基化序列和（ii）通过外切核酸酶消化捕获的DNA。 在消化的DNA片段的Illumina测序之后，特设的生物信息学管道提取信息用于进一步的下游分析。
【背景】基因组DNA中胞嘧啶的甲基化可以被蛋白质读取，并且主要被翻译成基因沉默。基因组中的大多数CpG二核苷酸是甲基化的，包括位于基因调控区如增强子的那些。然而，当需要时，这些CpG可以通过Ten Eleven Translocation（TET）酶将甲基氧化并且通过碱基切除修复系统用未甲基化的胞嘧啶置换来去甲基化。 5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）是5-甲基胞嘧啶的第一个氧化衍生物，并且在基因组中绘制该修饰的碱基提供了关于正在进行活性去甲基化的区域的信息。尽管选择性化学标记（SCL）可以非常特异地检测5hmC，但该技术的分辨率受DNA片段大小的限制，特别是当捕获的DNA中存在多个CpG时。为了提高分辨率，我们引入了使用外切核酸酶的消化步骤，所述核酸外切酶将DNA分子修剪成靠近羟甲基化的胞嘧啶（Sérandour et。，2016）。然后对测序读数进行适当的生物信息学处理，然后将羟甲基化评分赋予捕获的CpG。
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| Isolation of Rice Stripe Virus Preparation from Viruliferous Small Brown Planthoppers and Mechanic Inoculation on Rice
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Author:
Date:
2017-11-05
[Abstract] Tenuiviruses can infect the plants of the family Poaceae, and cause serious loss of crops, particularly rice and maize, in South-Eastern Asian countries. Tenuiviruses usually depend on insect vectors for their transmission and cannot be transmitted between plants through wounds or abrasions. Rice stripe virus (RSV), a typical member of tenuiviruses, is efficiently transmitted by the small brown planthopper Laodelphax striatellus in a persistent-propagative manner to cause rice stripe disease. Here we presented a convenient method, the midrib micro-injection, to mechanically inoculate insect-derived RSV into rice leaves for conducting pathogenicity assay on rice plants.
[摘要] 细菌病毒可以感染禾本科植物，并在东南亚国家造成严重的作物损失，特别是稻米和玉米。 病毒通常依靠昆虫载体传播，不能通过伤口或擦伤传播。 水稻条纹病毒（RSV）是典型的tenuiviruses的成员，以持续繁殖的方式被小型褐飞虱灰飞虱高效率地传播，导致水稻条纹病。 在这里，我们提出了一种方便的方法，即中微量注射，以机械方式将昆虫来源的RSV接种到水稻叶中，以对水稻植物进行致病性测定。
【背景】除非通过根据不同的实验细节从1％至90％的完全不同的传输速率进行血管穿刺接种（Louie，1995; Hogenhout等人，2008），否则不能将机器接种到植物中。至于RSV，机械传播通常失败或产生低感染率（Ling，1972）。特别地，从病变植物注射RSV粗提物后，传播率仅为6％（Okuyama and Asuyama，1959）。在这项工作中提到的中微注射方法将RSV传播率提高到17％。虽然机械传播RSV的发生率仍远低于昆虫载体传播（53％），但是我们的方法为持续繁殖的植物病毒的机械接种提供了便利的方法。此外，基于这种方法，可以在受感染的植物宿主中更精确地确定持续增殖植物病毒的复制和基因表达，而不受昆虫即接种剂量和昆虫蛋白质的干扰。
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| Antisense Oligonucleotide-mediated Knockdown in Mammary Tumor Organoids
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Author:
Date:
2017-08-20
[Abstract] Primary mammary tumor organoids grown in 3D are an excellent system to study tumor biology. They resemble the organization and physiology of native epithelia more closely than cancer cell lines grown in 2D, and additionally model interactions with the ECM (Boj et al., 2015; Clevers, 2016; Shamir and Ewald, 2014). Mammary tumor organoids are therefore a promising model system to identify and characterize novel drivers of breast cancer that would be unlikely to be identified using 2D cell lines. Antisense oligonucleotides can be used to efficiently and specifically knockdown target genes in the cell (Bennett et al., 2017). They can be taken up freely by organoids without the need for a transfection agent, making them a convenient tool for routine lab studies and screens.
[摘要] 在3D生长的原发性乳腺肿瘤组织是研究肿瘤生物学的优秀系统。 它们类似于天然上皮的组织和生理学，比2D生长的癌细胞系更为紧密，另外还与ECM的模型相互作用（Boj et al。，2015; Clevers，2016; Shamir and Ewald，2014）。 因此，乳腺肿瘤组织因子是一种有希望的模型系统，用于识别和表征不可能使用2D细胞系识别的乳腺癌的新型驱动因素。 反义寡核苷酸可用于有效和特异地敲低细胞中的靶基因（Bennett等，2017）。 它们可以被有机物自由摄取，而不需要转染剂，使其成为常规实验室研究和筛选的便捷工具。
【背景】乳腺癌是全世界妇女中最常见的恶性肿瘤，是妇女癌症死亡率的第二大原因（Siegel等，2017）。为了改善现有的治疗方案，确定和调查具有预防乳腺癌进展潜力的新分子靶标至关重要。我们应用RNA-seq来产生与正常乳腺上皮细胞相比在原发性乳腺肿瘤中失调的长非编码RNA（lncRNA）的综合目录，并将30个先前未表征的lncRNA作为乳腺肿瘤相关RNA（MaTARs）进行优先排序。为了功能评估MaTARs作为肿瘤进展的关键驱动因素，我们对3D乳腺肿瘤组织中的所有30个MaTARs进行了反义寡核苷酸（ASO）介导的敲低分析（Diermeier等，2016）。
ASO是短（20-mers），含有硫代磷酸酯修饰的核苷酸的单链DNA分子以及2'-ribose（5-10-5 ...
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