| Identification of Buffer Conditions for Optimal Thermostability and Solubility of Herpesviral Protein UL37 Using the Thermofluor Assay
|
|
Author:
Date:
2020-06-20
[Abstract] Structural and biochemical studies of proteins require high amounts of stable, purified proteins. Protein stability often depends on the buffer composition, which includes pH and concentration of salts or other solutes such as glycerol, hence an efficient method for identifying optimal buffer conditions for stability would minimize time and resources used for protein purification and further studies. This protocol describes the use of the Thermofluor assay, in combination with a custom 24-condition screen, to identify buffer conditions that increase protein thermostability, using the conserved herpesviral protein UL37 as an example. Detailed instructions on screen conditions, running the Thermofluor MATLAB script, and analyzing the data are provided. In comparison to circular dichroism ...
[摘要] [摘要]蛋白质的结构和生化研究需要大量稳定、纯化的蛋白质。蛋白质的稳定性通常取决于缓冲液的组成，其中包括pH值和盐或其他溶质（如甘油）的浓度，因此，确定最佳缓冲液稳定性条件的有效方法可以将用于蛋白质纯化和进一步研究的时间和资源减至最少。本协议描述了使用热氟分析，结合自定义的24条件筛选，以确定缓冲条件，增加蛋白质热稳定性，使用保存的疱疹病毒蛋白UL37为例。详细说明了屏幕条件，运行Thermofluor的MATLAB脚本，并对数据进行了分析。与圆二色谱法（CD）相比，缓冲屏结合热荧光分析法为蛋白质热稳定性分析提供了一种快速、信息量大的方法。
[背景]蛋白UL37在疱疹病毒的生命周期中具有多种功能，是高效病毒复制所必需的。作为病毒膜的一个组成部分——夹在包含衣壳和脂质膜的基因组之间的一层——UL37不仅是病毒组装所必需的（Desai等人，2001年；Jambunathan等人，2014年），而且也是有效的衣壳运输（Leege等人，2009年）、神经入侵（Richards等人，2017年）和对抗宿主天然免疫应答（Liu等人，2008；Zhao等人，2016）。要更好地理解其多功能性的本质，就需要对其结构和生化特性有详细的了解，而这又需要性能良好的纯化蛋白质。
不同UL37结构体的初始制备在溶解度、单分散性和纯化蛋白的产率方面存在差异，使得蛋白制备不一致，进一步的表征也不可重现。由于缓冲优化是解决这些问题的直接方法，我们开发了一种24条件筛选法，可以改变缓冲剂、pH值以及NaCl和甘油的浓度，并将其与热氟分析法结合使用（Phillips等人，2011年），以确定最大限度提高热稳定性的缓冲条件。UL37的N端和C端具有可变的平均热稳定性和最佳缓冲条件（图1，表1）。然而，在所有情况下，提高蛋白质稳定性的条件也提高了蛋白质的溶解度，最终提高了纯化蛋白质的产量，从而促进了下游的生化特性。 ...
|
|
|
| Immunogold Electron Microscopy of the Autophagosome Marker LC3
|
|
Author:
Date:
2017-12-20
[Abstract] Even though autophagy was firstly observed by transmission electron microscopy already in the 1950s (reviewed in Eskelinen et al., 2011), nowadays this technique remains one of the most powerful systems to monitor autophagic processes. The autophagosome, an LC3-positive double membrane structures enclosing cellular materials, represents the key organelle in autophagy and its simple visualization and/or numeration allow to draw important conclusions about the autophagic flux. Therefore, the accurate identification of autophagosomes is crucial for a comprehensive and detailed dissection of autophagy. Here we present a simple protocol to identify autophagosomes by transmission electron microscopy coupled to immunogold labeling of LC3 starting from a relatively low cell number, which ...
[摘要] 尽管早在20世纪50年代就已经通过透射电子显微镜观察了自噬（在Eskelinen等人2011年的综述中），但是现在这种技术仍然是监测自噬过程的最强大的系统之一。 自噬体是包含细胞物质的LC3阳性双层膜结构，代表了自噬的关键细胞器，其简单的可视化和/或计数允许得出关于自噬流的重要结论。 因此，准确鉴定自噬体对自噬的全面和详细的分析至关重要。 在这里我们提出一个简单的协议，以确定autophagosomes透射电子显微镜耦合LC3的免疫金标记从一个相对较低的细胞数量，我们最近开发遵循病毒介导的人类癌变期间的自噬途径。
【背景】自噬体代表了macroautophagy的关键结构，这是一种细胞胞质成分的分解代谢系统。巨自噬（或简单地自吞噬）由吞噬细胞的形成引发，所述吞噬细胞能够自身扩张吞噬细胞器和蛋白质，所述蛋白质最终闭合在螯合成分周围形成被称为自噬体的细胞器。接下来，在成熟过程中，自噬体可以与溶酶体融合以形成自溶酶体，其中被捕获的物质被位于溶酶体限制性膜中的泵降解并再循环回（Glick et al。，2010）。
由于自噬功能障碍与各种人类疾病，病毒感染，神经退行性疾病，免疫功能和癌症有关（Schneider and ...
|
|
|
| Histochemical Preparations to Depict the Structure of Cauliflower Leaf Hydathodes
|
|
Author:
Date:
2017-10-20
[Abstract] Hydathodes are plant organs present on leaf margins of a wide range of vascular plants and are the sites of guttation. Both anatomy and physiology of hydathodes are poorly documented. We have recently reported on the anatomy of cauliflower and Arabidopsis thaliana hydathodes and on their infection by the vascular pathogenic bacterium Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) (Cerutti et al., 2017). Because hydathodes are natural infection routes for several pathogens, it is necessary to have a deep knowledge of their anatomy to further better interpret images of infected hydathodes. Here, we described different detailed protocols for gaining information on hydathode anatomy which are applicable to a wide range of plants (including monocots ...
[摘要] 水溶性植物是存在于各种维管植物的叶缘上的植物器官，是排列的位置。水解的解剖学和生理学都很少被证明。我们最近报道了花椰菜和拟南芥水解的解剖结构及其血管病原菌黄单胞菌（Xanthomonas campestris）pv的感染。 Cerutti等人，2017）。由于水阴是多种病原体的自然感染途径，因此需要对其解剖学有深入的了解，以进一步更好地解释受感染水合物的图像。在这里，我们描述了不同的详细方案，以获得适用于广泛植物（包括单子叶植物如大麦和水稻）的水溶性解剖学信息。用Nomarsky和共焦显微镜观察澄清的厚样品。透射光和透射电子显微镜中的光学显微镜用于观察薄和超薄切片。
【背景】在文献中，使用不同的技术来研究水溶性（Perrin，1972; Chen and Chen，2007; Wang等人，2011; Singh，2014）。 从光学显微镜（在整个组织或树脂嵌入样品的部分）到扫描或透射电子显微镜，可以使用大型方案和技术。 据我们所知，这些技术并不被组合使用，激光共焦显微镜从未用于描绘水溶性结构。 此外，我们注意到从协议到协议的变化。 我们在这里介绍了组合使用的不同技术。 它们适合花椰菜和拟南芥（Arabidopsis thaliana）。 它们已成功应用于其他植物，如单子叶植物（大麦和大米），应适用于各种植物物种。 ...
|
|
|