|
Author:
Date:
2018-02-05
[Abstract] Protein tagging is a powerful tool for performing comprehensive analyses of the biological functions of a protein of interest owing to the existence of a wide variety of tags. It becomes indispensable in some cases, such as in tracking protein dynamics in a live cell or adding a peptide epitope due to the lack of optimal antibodies. However, efficiently integrating an array of tags into the gene of interest remains a challenge. Traditional DNA recombinant technology based on type II restriction endonucleases renders protein tagging tedious and inefficient as well as the introduction of an unwanted junction sequence. In our attempt to tag Thrombospondin type 1 domain-containing 1 (THSD1) that we identified as the first intracranial aneurysm gene (Santiago-Sim et al., 2016), we ...
[摘要] 由于各种标签的存在，蛋白质标签是一种对感兴趣的蛋白质的生物学功能进行全面分析的有力工具。在某些情况下，例如跟踪活细胞中的蛋白质动态变化或由于缺乏最佳抗体而添加肽表位，这变得不可或缺。然而，将一系列标签有效地整合到感兴趣的基因中仍然是一个挑战。基于II型限制性内切核酸酶的传统DNA重组技术使得蛋白质标记繁琐且效率低下以及引入不需要的连接序列。我们试图标记我们确定为第一个颅内动脉瘤基因的血小板反应蛋白1型结构域1（THSD1）（Santiago-Sim等人，2016），我们开发了一种新型精确标记技术，组合使用II型和IIS限制性核酸内切酶（Xu等人，2017），其产生高效率的无缝克隆。在这里，我们描述了一个协议，不仅为任何感兴趣的基因提供了一个广义的策略，而且还将THSD1中的11个不同标签的应用作为一个循序渐进的例子。
【背景】具有不同特征的多功能标签可以作为一组分析蛋白质功能的工具。诸如绿色荧光蛋白（GFP）标签及其衍生物，串联亲和纯化标签（如FLAG-HA或ProtA-CBP）的各种标签多年来革新了生物学研究。一些新开发的化学标签，如SNAP或CLIP，允许以时间控制的方式有条件地标记感兴趣的蛋白质（Bodor等人，2012）。然而，有效地将尽可能多的不同标签整合到感兴趣的基因中的方法发展不足。
传统的DNA重组利用识别回文序列的II型限制性内切核酸酶。例如，Eco ...
|
|
Author:
Date:
2017-08-05
[Abstract] The establishment of the CRISPR/Cas9 technology in diatoms (Hopes et al., 2016; Nymark et al., 2016) enables a simple, inexpensive and effective way of introducing targeted alterations in the genomic DNA of this highly important group of eukaryotic phytoplankton. Diatoms are of interest as model microorganisms in a variety of areas ranging from oceanography to materials science, in nano- and environmental biotechnology, and are presently being investigated as a source of renewable carbon-neutral fuel and chemicals. Here we present a detailed protocol of how to perform CRISPR/Cas9 gene editing of the marine diatom Phaeodactylum tricornutum, including: 1) insertion of guide RNA target site in the diatom optimized CRISPR/Cas9 vector (pKS diaCas9-sgRNA), 2) ...
[摘要] 在硅藻（Hopes ，2016; Nymark等人，2016）中建立了CRISPR / Cas9技术，使得能够简单，廉价和有效地引入目标 这个非常重要的真核浮游植物群的基因组DNA的改变。 硅藻在纳米和环境生物技术领域从海洋学到材料科学，各种领域的示范性微生物都是有意义的，目前正在作为可再生碳中和燃料和化学品的来源进行调查。 在这里，我们提出了如何进行海洋硅藻三角褐指藻CRISPR / Cas9基因编辑的详细方案，包括：1）在硅藻优化的CRISPR / Cas9载体（pKS diaCas9）中插入引导RNA靶位点 -sgRNA），2）用于将pKS diaCas9-sgRNA质粒导入P的生物弹道转化。 三分支毛细胞和3）基于高分辨率熔融的PCR测定以筛选CRISPR / Cas9诱导的突变。
【背景】CRISPR / Cas9系统已被证明是许多真核生物中非常有效和成功的基因组编辑系统，现在也包括微藻（Hopes等人，2016; Nymark等人）。 ，2016; Shin 等人，2016）。 CRISPR / Cas9系统包括引导RNA（gRNA）和称为Cas9的核酸酶（Sander and Joung，2014）。 这两个分子形成复合物，其中gRNA将复合物引导至感兴趣的靶标。 ...
|