| In vitro Analysis of Ubiquitin-like Protein Modification in Archaea
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Author:
Date:
2018-05-20
[Abstract] The ubiquitin-like (Ubl) protein is widely distributed in Archaea and involved in many cellular pathways. A well-established method to reconstitute archaeal Ubl protein conjugation in vitro is important to better understand the process of archaeal Ubl protein modification. This protocol describes the in vitro reconstitution of Ubl protein modification and following analysis of this modification in Haloferax volcanii, a halophilic archaeon serving as the model organism.
[摘要] 泛素样（Ubl）蛋白广泛分布于古细菌中并参与许多细胞途径。 为了更好地理解古细菌Ub1蛋白质修饰的过程，重建体外古细菌Ubl蛋白质缀合物的完善方法是很重要的。 该协议描述了Ubl蛋白质修饰的体外重建以及在作为模型生物的嗜盐古细菌Haloferax volcanii 中对这种修饰进行分析。
【背景】泛素（Ub）与靶蛋白共价连接的过程被称为泛素化，其控制真核细胞中大量的细胞过程（Glickman和Ciechanover，2002; Komander和Rape，2012）。遍在蛋白化由一系列酶（包括Ub激活酶（E1），Ub结合酶（E2s）和Ub连接酶（E3s））催化。泛素化的体外重建是确定酶之间或E3与蛋白质底物之间特异性的有用测定法（Zhao等人，2012）。在古细菌中，Ubl蛋白SAMP采用Ub折叠，并且与E1样酶UbaA催化的蛋白靶标异肽连接[Maupin-Furlow，（2014）综述]。尽管E1同系物在古细菌中广泛存在，但基于一级序列比较，在大多数古细菌中未预测经典E2或E3酶。我们最近对Haloferax volcanii的研究表明甲硫氨酸亚砜还原酶A（MsrA）是Ubl蛋白质修饰（sampylation）与UbaA一起在体内温和的氧化条件下和< （体外）（fu="">
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| Primary Culture System for Germ Cells from Caenorhabditis elegans Tumorous Germline Mutants
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Author:
Date:
2017-08-05
[Abstract] The Caenorhabditis elegans germ line is an important model system for the study of germ stem cells. Wild-type C. elegans germ cells are syncytial and therefore cannot be isolated in in vitro cultures. In contrast, the germ cells from tumorous mutants can be fully cellularized and isolated intact from the mutant animals. Here we describe a detailed protocol for the isolation of germ cells from tumorous mutants that allows the germ cells to be maintained for extended periods in an in vitro primary culture. This protocol has been adapted from Chaudhari et al., 2016.
[摘要] 秀丽隐杆线虫种系是胚芽干细胞研究的重要模型系统。 野生型C。 线虫生殖细胞是合胞体，因此不能在体外培养中分离。 相比之下，来自肿瘤突变体的生殖细胞可以完全被细胞化并从突变动物中完整分离。 在这里，我们描述了从肿瘤突变体中分离生殖细胞的详细方案，其允许生殖细胞在体外原代培养中长时间维持。 该协议已从2016年Chaudhari等人改编。
【背景】秀丽生殖细胞在位于两个性腺臂的远端区域的两个成体干细胞龛中产生（Hansen和Schedl，2013; Kimble和Seidel，2013）。在野生型雌雄同体中，有丝分裂生殖细胞仅限于性腺臂的远端，干细胞生态位。野生型生殖细胞是合胞体，并且包含延伸通过性腺臂中心区域的共同细胞质的开口。 ℃。线虫肿瘤种系突变体在整个性腺中增加了生殖细胞的有丝分裂增殖。我们发现肿瘤种系突变体通常具有完整的细胞生殖细胞，其含有完整的质膜（Chaudhari等人，2016）。这种细胞化允许生殖细胞的分离及其在培养中的维持。该方案描述了分离和维持培养物中肿瘤突变体的生殖细胞的方法学和组织培养基。虽然已经描述了用于C的主要培养物的培养基。 elegans 胚胎和幼虫细胞（Strange等人，2007; Zhang和Kuhn，2013），生殖细胞在这种培养基中不能存活（Chaudhari等人。 ...
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