| Observing Nutrient Gradients, Gene Expression and Growth Variation Using the "Yeast Machine" Microfluidic Device
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Author:
Date:
2020-07-05
[Abstract] The natural environment of microbial cells like bacteria and yeast is often a complex community in which growth and internal organization reflect morphogenetic processes and interactions that are dependent on spatial position and time. While most of research is performed in simple homogeneous environments (e.g., bulk liquid cultures), which cannot capture full spatiotemporal community dynamics, studying biofilms or colonies is complex and usually does not give access to the spatiotemporal dynamics at single cell level. Here, we detail a protocol for generation of a microfluidic device, the “yeast machine”, with arrays of long monolayers of yeast colonies to advance the global understanding of how intercellular metabolic interactions affect the internal structure of colonies ...
[摘要] [摘要 ] 微生物细胞（如细菌和酵母菌）的自然环境通常是一个复杂的社区，在该社区中，生长和内部组织反映了形态发生过程和相互作用，这些过程和相互作用取决于空间位置和时间。虽然大多数研究是在无法捕获完整时空群落动态的简单同质环境（例如，大量液体培养）中进行的，但研究生物膜或菌落却很复杂，通常无法在单个细胞水平上获得时空动态。在这里，我们详细介绍了一种用于生成微流控设备（“酵母机器”）的协议，该协议带有酵母菌落的长单层阵列，以推进对细胞间代谢相互作用如何影响已定义和可定制的空间尺寸内菌落内部结构的全球了解。以酿酒酵母作为模型酵母系统，我们使用“酵母机器”通过追踪荧光标记的己糖转运蛋白来证明葡萄糖梯度的出现。我们进一步量化了菌落内生长速率的表达空间模式和葡萄糖可利用性调控的其他基因的表达。除此之外，我们显示出氨基酸的梯度也在菌落内形成，潜在地打开了类似的方法来研究许多其他营养物和代谢废物的梯度的时空形成。该方法将来可用于在与生态学和进化有关的单细胞分辨率和时标下，破译其他相同物种或更复杂的多物种系统中的远程代谢相互作用，细胞发育和形态发生之间的相互作用。
[背景 ] ...
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| Digestion of Peptidoglycan and Analysis of Soluble Fragments
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Author:
Date:
2017-08-05
[Abstract] Peptidoglycan (murein) is a vital component of the cell wall of nearly all bacteria, composed of sugars linked by short peptides. This protocol describes the purification of macromolecular peptidoglycan from cultured bacteria and the analysis of enzyme-digested peptidoglycan fragments using high performance liquid chromatography (HPLC). Digested peptidoglycan fragments can be identified by mass spectrometry, or predicted by comparing retention times with other published chromatograms. The quantitative nature of this method allows for the measurement of changes to peptidoglycan composition between different species of bacteria, growth conditions, or mutations. This method can determine the overall architecture of peptidoglycan, such as peptide stem length, the extent of cross-linking, and ...
[摘要] 肽聚糖（murein）是由短肽连接的糖组成的几乎所有细菌的细胞壁的重要组成部分。 该方案描述了从培养细菌中纯化大分子肽聚糖和使用高效液相色谱（HPLC）分析酶消化的肽聚糖片段。 消化的肽聚糖片段可以通过质谱鉴定，或通过比较保留时间与其他公开的色谱图预测。 该方法的定量性质允许测量不同种类的细菌，生长条件或突变之间肽聚糖组成的变化。 该方法可以确定肽聚糖的总体结构，如肽长度，交联程度和修饰。 已经使用神经肽分析来研究肽聚糖相关蛋白的功能和细菌获得抗生素抗性的机制。
【背景】肽聚糖由通过肽干连接在一起的糖骨架组成，其产生对细胞形状重要的网状结构和细菌细胞的膨胀压力。大分子肽聚糖从在细胞质中合成的单体单元组装，并由具有5个氨基酸的茎组成的具有5个氨基酸的葡萄糖胺和N-乙酰氨基葡萄糖二糖组成。当单体翻转到周质中时，通过反式糖基化将其加入到聚糖链中，并且通过转肽酶将一部分肽茎连接在一起。
＆NBSP;包含肽干的氨基酸可以根据物种变化，但通常以L-丙氨酸，D-谷氨酸，内消旋二氨基庚二酸，D-丙氨酸，D-丙氨酸，丙氨酸，在一些革兰氏阳性中，L-赖氨酸代替二氨基庚二酸。通过直接或通过连接氨基酸连接第三或第四氨基酸的第三个氨基酸的游离胺进行交联（Schleifer和Kandler，1972）。其他常见的修饰包括氨基酸的酰胺化（Kato和Strominger，1968）和O-乙酰化（Clarke和Dupont，1992）或者N-脱乙酰化（Araki ...
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