| Preserve Cultured Cell Cytonemes through a Modified Electron Microscopy Fixation
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Author:
Date:
2018-07-05
[Abstract] Immunocytochemistry of cultured cells is a common and effective technique for determining compositions and localizations of proteins within cellular structures. However, traditional cultured cell fixation and staining protocols are not effective in preserving cultured cell cytonemes, long specialized filopodia that are dedicated to morphogen transport. As a result, limited mechanistic interrogation has been performed to assess their regulation. We developed a fixation protocol for cultured cells that preserves cytonemes, which allows for immunofluorescent analysis of endogenous and over-expressed proteins localizing to the delicate cellular structures.
[摘要] 培养细胞的免疫细胞化学是用于确定细胞结构内蛋白质的组成和定位的常用且有效的技术。 然而，传统的培养细胞固定和染色方案不能有效地保存培养的细胞色素，长期专门用于形态发生转运的丝状伪足。 结果，进行了有限的机械审讯以评估其监管。 我们开发了一种用于培养细胞的固定方案，该方案保留了细胞质，允许对内源性和过表达的蛋白质进行免疫荧光分析，这些蛋白质定位于脆弱的细胞结构。
【背景】Cytonemes被分类为薄的（~200nm直径）基于肌动蛋白的丝状伪足，长度超过2μm，可以转运形态发生素（Ramírez-Weber和Kornberg，1999）。这些信号结构首先在发育中的 Drosophila 翼成像盘中进行了详细分类和描述，随后在小鼠，小鸡和斑马鱼模型生物中进行了观察（Ramírez-Weber和Kornberg，1999; Sanders et al。，2013; Stanganello et al。，2015）。在大多数情况下，只有对过表达的荧光标记蛋白进行实时成像才能进行细胞色素检测。由于传统的固定方案未能保存这些脆弱的细丝，因此对培养细胞的细胞色素的检查受到限制。这些并发症一直是决定在发育和组织稳态期间驱动细胞色素形成和功能的细胞机制以及确定这些过程是否在疾病中被破坏的限制因素。
为了克服这些限制，我们开发了一种基于修饰电子显微镜固定剂（MEM-fix）的方案，该方案可以保留培养细胞的细胞质。 ...
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| Digestion of Peptidoglycan and Analysis of Soluble Fragments
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Author:
Date:
2017-08-05
[Abstract] Peptidoglycan (murein) is a vital component of the cell wall of nearly all bacteria, composed of sugars linked by short peptides. This protocol describes the purification of macromolecular peptidoglycan from cultured bacteria and the analysis of enzyme-digested peptidoglycan fragments using high performance liquid chromatography (HPLC). Digested peptidoglycan fragments can be identified by mass spectrometry, or predicted by comparing retention times with other published chromatograms. The quantitative nature of this method allows for the measurement of changes to peptidoglycan composition between different species of bacteria, growth conditions, or mutations. This method can determine the overall architecture of peptidoglycan, such as peptide stem length, the extent of cross-linking, and ...
[摘要] 肽聚糖（murein）是由短肽连接的糖组成的几乎所有细菌的细胞壁的重要组成部分。 该方案描述了从培养细菌中纯化大分子肽聚糖和使用高效液相色谱（HPLC）分析酶消化的肽聚糖片段。 消化的肽聚糖片段可以通过质谱鉴定，或通过比较保留时间与其他公开的色谱图预测。 该方法的定量性质允许测量不同种类的细菌，生长条件或突变之间肽聚糖组成的变化。 该方法可以确定肽聚糖的总体结构，如肽长度，交联程度和修饰。 已经使用神经肽分析来研究肽聚糖相关蛋白的功能和细菌获得抗生素抗性的机制。
【背景】肽聚糖由通过肽干连接在一起的糖骨架组成，其产生对细胞形状重要的网状结构和细菌细胞的膨胀压力。大分子肽聚糖从在细胞质中合成的单体单元组装，并由具有5个氨基酸的茎组成的具有5个氨基酸的葡萄糖胺和N-乙酰氨基葡萄糖二糖组成。当单体翻转到周质中时，通过反式糖基化将其加入到聚糖链中，并且通过转肽酶将一部分肽茎连接在一起。
＆NBSP;包含肽干的氨基酸可以根据物种变化，但通常以L-丙氨酸，D-谷氨酸，内消旋二氨基庚二酸，D-丙氨酸，D-丙氨酸，丙氨酸，在一些革兰氏阳性中，L-赖氨酸代替二氨基庚二酸。通过直接或通过连接氨基酸连接第三或第四氨基酸的第三个氨基酸的游离胺进行交联（Schleifer和Kandler，1972）。其他常见的修饰包括氨基酸的酰胺化（Kato和Strominger，1968）和O-乙酰化（Clarke和Dupont，1992）或者N-脱乙酰化（Araki ...
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