| Liposome Disruption Assay to Examine Lytic Properties of Biomolecules
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Author:
Date:
2017-08-05
[Abstract] Proteins may have three dimensional structural or amino acid features that suggest a role in targeting and disrupting lipids within cell membranes. It is often necessary to experimentally investigate if these proteins and biomolecules are able to disrupt membranes in order to conclusively characterize the function of these biomolecules. Here, we describe an in vitro assay to evaluate the membrane lytic properties of proteins and biomolecules. Large unilamellar vesicles (liposomes) containing carboxyfluorescein at fluorescence-quenching concentrations are treated with the biomolecule of interest. A resulting increase in fluorescence due to leakage of the dye from liposomes and subsequent dilution in the buffer demonstrates that the biomolecule is sufficient for disrupting ...
[摘要] 蛋白质可以具有三维结构或氨基酸特征，其表明在细胞膜内靶向和破坏脂质的作用。通常有必要进行实验研究，如果这些蛋白质和生物分子能够破坏膜，以确定性地表征这些生物分子的功能。在这里，我们描述了一种体外实验来评估蛋白质和生物分子的膜裂解性质。用荧光猝灭浓度含有羧基荧光素的大单层囊泡（脂质体）用感兴趣的生物分子进行处理。由于染料从脂质体泄漏而导致的荧光增加，随后在缓冲液中的稀释表明生物分子足以破坏脂质体和膜。另外，由于脂质体破裂可能通过孔形成或通过类似于洗涤剂的脂类的一般溶解而发生，因此我们提供了区分这两种机制的方法。可以通过检查与适合孔的葡聚糖分子的羧基荧光素释放的封锁来鉴定和评估孔形成。这里描述的方法用于确定疟疾疫苗候选人CelTOS和促凋亡Bax通过孔形成破坏脂质体（Saito等人，2000; Jimah等人，2016） ）。由于生物分子的膜脂质结合先于膜破裂，我们推荐使用伴侣方案：Jimah等人，2017。
【背景】该方案提出了评估蛋白质和其他生物分子的膜裂解性质的程序。该方案旨在清楚地描述研究生物分子的膜破坏性质所需的各种实验步骤。最后，该方案描述了膜破坏的定量测量，可用于提供对脂质体破坏的动力学和机制的了解。该方案成功地用于研究疟疾疫苗候选人CelTOS，其提供了对CelTOS的第一次体外功能测定的清楚描述。该方案的应用揭示，对于不饱和脂肪酸和多孔元素的CelTOS（透明性蛋白质）破坏了含有磷脂酸的膜。这一见解表明，CelTOS由入侵宿主细胞内的疟疾寄生虫分泌，以破坏宿主细胞膜并使寄生虫出现（Jimah等人，2016）。最后，该测定可以容易地应用于研究小分子，抗体或肽对CelTOS介导的脂质体破坏的抑制。当为CelTOS设计时，该协议易于泛化，适用于任何其他感兴趣的生物分子。 ...
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| Behavioral and Functional Assays for Investigating Mechanisms of Noxious Cold Detection and Multimodal Sensory Processing in Drosophila Larvae
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Author:
Date:
2017-07-05
[Abstract] To investigate cellular, molecular and behavioral mechanisms of noxious cold detection, we developed cold plate behavioral assays and quantitative means for evaluating the predominant noxious cold-evoked contraction behavior. To characterize neural activity in response to noxious cold, we implemented a GCaMP6-based calcium imaging assay enabling in vivo studies of intracellular calcium dynamics in intact Drosophila larvae. We identified Drosophila class III multidendritic (md) sensory neurons as multimodal sensors of innocuous mechanical and noxious cold stimuli and to dissect the mechanistic bases of multimodal sensory processing we developed two independent functional assays. First, we developed an optogenetic dose response assay to assess whether levels of ...
[摘要] 为了研究有害感冒检测的细胞，分子和行为机制，我们开发了冷板行为测定和评估主要有害冷诱发收缩行为的定量方法。为了表征响应于有害感冒的神经活动，我们实施了基于GCaMP6的钙成像测定，其能够在完整的果蝇幼虫中进行体内细胞内钙动力学研究。我们将果蝇III型多发感染（md）感觉神经元识别为无机械和有害冷刺激的多模态传感器，并解剖多模态感觉加工的机理基础，我们开发了两项独立的功能测定。首先，我们开发了一种光遗传剂量反应测定法，以评估神经激活水平是否有助于感觉感觉神经元的多模态方面。其次，我们利用CaMPARI，一种可开关的钙积分器，可以在高细胞内钙和光转换光的存在下，将荧光从绿色稳定转变为红色，以评估体内的神经激活水平之间的功能差异无害的机械和有害的冷刺激。这些新颖的测定能够研究在果蝇幼虫中外周感觉神经元和多峰感官处理的行为和功能作用。
【背景】感觉和适应环境线索的能力是后生动物共享的最根本的方面之一。感测潜在的有害刺激，如有毒温度，化学或机械侮辱和适当的反应对于避免可能导致人身伤害或死亡的初期损害至关重要。通常，在感测伤害感受刺激时，动物产生一组避免行为，其减轻或允许动物逃离有害刺激。阐明加工伤害性刺激的分子，细胞和行为水平机制是非常有意义的，因为鉴定和开发用于异常感觉加工的新型治疗干预的潜力可能导致神经性疼痛。在黑腹果蝇幼虫和成虫中已经阐明了对有毒化学，机械和热刺激的感觉和行为反应，然而，近来在幼虫中发现了有害的感冒检测（Im和Galko，2012; ...
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