| A Highly Sensitive Anion Exchange Chromatography Method for Measuring cGAS Activity in vitro
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Author:
Date:
2018-10-20
[Abstract] Cyclic GMP-AMP synthase (cGAS) is a pattern recognition receptor (PRR) that senses double stranded DNA (dsDNA) in the cytosol and this leads to the activation of stimulator of interferon genes (STING) via the secondary messenger 2’3’-cyclic GMP-AMP (2’3’-cGAMP). STING then recruits TANK binding kinase 1 (TBK-1) and this complex can phosphorylate and activate interferon regulatory factor 3 (IRF3) leading to the induction of type I interferons and other antiviral genes. The cGAS:DNA complex catalyzes the synthesis of 2’3’-cGAMP and the purpose of the protocol presented here is to measure the in vitro activity of purified cGAS in the presence of dsDNA. The protocol was developed to elucidate the relationship between dsDNA length and the level of cGAS activity. The method involves an in ...
[摘要] 环状GMP-AMP合酶（cGAS）是一种模式识别受体（PRR），可以感知胞质溶胶中的双链DNA（dsDNA），并通过第二信使2'3'来激活干扰素基因刺激物（STING）。环GMP-AMP（2'3'-cGAMP）。然后STING募集TANK结合激酶1（TBK-1），该复合物可磷酸化并激活干扰素调节因子3（IRF3），导致I型干扰素和其他抗病毒基因的诱导。 cGAS：DNA复合物催化2'3'-cGAMP的合成，这里提出的方案的目的是测量在dsDNA存在下纯化的cGAS的体外>活性。开发该方案是为了阐明dsDNA长度与cGAS活性水平之间的关系。该方法涉及与低浓度cGAS和dsDNA的体外>反应，然后使用阴离子交换色谱法定量反应产物。当比较不同DNA片段激活cGAS的能力时，低浓度的cGAS和dsDNA以及该测定的高灵敏度是关键优势。
【背景】细胞胞质内存在双链DNA是DNA或逆转录病毒感染的潜在迹象。核苷酸转移酶cGAS作为感知细胞溶质dsDNA的模式识别受体起作用。 cGAS被dsDNA变构激活并催化ATP和GTP转化为环状二核苷酸2'3'-cGAMP（或简称cGAMP）（Ablasser et al。>，2013; Civril et al 。>，2013; Diner et al。>，2013; Gao et al。>，2013; ...
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| BMV Propagation, Extraction and Purification Using Chromatographic Methods
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Author:
Date:
2018-07-20
[Abstract] Brome mosaic virus (BMV) is a well-known plant virus representing single-stranded RNA (ssRNA) positive-sense viruses. It has been widely used as a model in multiple studies concerning plant virus biology, epidemiology and the application of viral capsids in nanotechnology. Herein, we describe a method for BMV purification based on ion-exchange and size-exclusion chromatography. The presented method is of similar efficiency to previously described protocols relying on differential centrifugation and can easily be scaled up. The resulting BMV capsids are stable and monodisperse and can be used for further applications.
[摘要] 雀麦花叶病毒（BMV）是众所周知的植物病毒，代表单链RNA（ssRNA）正义病毒。 它已被广泛用作植物病毒生物学，流行病学和病毒衣壳在纳米技术中的应用的多项研究中的模型。 在本文中，我们描述了基于离子交换和尺寸排阻色谱的BMV纯化方法。 所提出的方法与先前描述的依赖于差速离心的方案具有相似的效率，并且可以容易地按比例放大。 得到的BMV衣壳是稳定的并且是单分散的，并且可以用于进一步的应用。
【背景】纳米技术要克服的关键挑战之一是制定有效的和组织特异性的药物递送方法。植物病毒和病毒样颗粒（VLP）具有生物相容性和可生物降解性，不含对人类或动物健康有害的病原体，是合成药物载体的安全替代品，通常会激活免疫系统的不良反应或积聚在免疫系统中。身体到毒性水平。最后，病毒衣壳的生产相对便宜且快速（Ren et al。，2007; Arcangeli et al。，2014）。
Bromoviridae 家族的雀麦花叶病毒（BMV）是用作纳米颗粒载体的良好候选物，因为它显示出所有上述特征并且是研究最多的植物病毒之一（Figlerowicz，2000; Alejska et al。，2005; Urbanowicz et al。，2005; Wierzchoslawski et al。，2006; Kao vet al。 ...
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| Genome Editing in Diatoms Using CRISPR-Cas to Induce Precise Bi-allelic Deletions
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Author:
Date:
2017-12-05
[Abstract] Genome editing in diatoms has recently been established for the model species Phaeodactylum tricornutum and Thalassiosira pseudonana. The present protocol, although developed for T. pseudonana, can be modified to edit any diatom genome as we utilize the flexible, modular Golden Gate cloning system. The main steps include how to design a construct using Golden Gate cloning for targeting two sites, allowing a precise deletion to be introduced into the target gene. The transformation protocol is explained, as are the methods for screening using band shift assay and/or restriction site loss.
[摘要] 最近为三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）和海绵假丝酵母（Thalassiosira pseudonana）建立了硅藻基因组编辑。 目前的协议，虽然开发的 T。 pseudonana ，可以修改编辑任何硅藻基因组，因为我们利用灵活，模块化的金门克隆系统。 主要步骤包括如何设计构建使用金门克隆靶向两个网站，允许一个精确的删除被引入目标基因。 解释转化方案，以及使用带移位测定和/或限制性位点丢失进行筛选的方法。
【背景】CRISPR-Cas正在迅速成为分子研究的一个关键方法。基于在细菌和古细菌中发现的病毒防御机制，CRISPR-Cas诱导基因组中精确位置的双链断裂（DSBs）。它涉及使用与CRISPR ...
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