| Plant ARGONAUTE Protein Immunopurification for Pathogen Cross Kingdom Small RNA Analysis
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Author:
Date:
2021-02-05
[Abstract] Over the last decade, it has been noticed that microbial pathogens and pests deliver small RNA (sRNA) effectors into their host plants to manipulate plant physiology and immunity for infection, known as cross kingdom RNA interference. In this process, fungal and oomycete parasite sRNAs hijack the plant ARGONAUTE (AGO)/RNA-induced silencing complex to post-transcriptionally silence host target genes. We hereby describe the methodological details of how we recovered cross kingdom sRNA effectors of the oomycete pathogen Hyaloperonospora arabidopsidis during infection of its host plant Arabidopsis thaliana. This Bio-protocol contains two parts: first, a detailed description on the procedure of plant AGO/sRNA co-immunopurification and sRNA recovery for Illumina high throughput sequencing ...
[摘要] [摘要]在过去的十年中，已经注意到，微生物病原体和害虫将小RNA（sRNA）效应子传递到宿主植物中，以操纵植物生理学和免疫力，称为跨界RNA干扰。在此过程中，真菌和卵菌寄生虫sRNA劫持了植物ARGONAUTE（AGO）/ RNA诱导的沉默复合体，以转录后沉默宿主靶基因。我们在此描述方法学的细节，我们如何在宿主植物拟南芥感染期间恢复卵菌病原体拟南芥的跨界sRNA效应子。该生物协议包含两个部分：第一，关于植物AGO / sRNA co- 免疫纯化和sRNA回收，用于Illumina高通量测序分析。其次，我们解释了如何进行生物信息学小号斯尔纳序列分析读取可使用Galaxy服务器。原则上，该协议适用于研究来自多种宿主植物和植物相互作用（微生物）的AGO结合的sRNA。
[背景]小RNA（sRNA）可以充当病原体效应物，劫持植物ARGONAUTE（AGO）/ RNA诱导的沉默复合物（RISC），并使宿主mRNA沉默以进行感染，这种病毒被称为跨界RNA干扰的毒力机制（Weiberg等。，2015； Zeng等，2019）。分析感染期间与植物AGO结合的sRNA的库是一种选择方法，以全面了解可能通过宿主AGO / RISC起作用的植物入侵性病原体sRNA。基于抗体的植物AGO / ...
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| Generation of Targeted Knockout Mutants in Arabidopsis thaliana Using CRISPR/Cas9
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Author:
Date:
2017-07-05
[Abstract] The CRISPR/Cas9 system has emerged as a powerful tool for gene editing in plants and beyond. We have developed a plant vector system for targeted Cas9-dependent mutagenesis of genes in up to two different target sites in Arabidopsis thaliana. This protocol describes a simple 1-week cloning procedure for a single T-DNA vector containing the genes for Cas9 and sgRNAs, as well as the detection of induced mutations in planta. The procedure can likely be adapted for other transformable plant species.
[摘要] CRISPR / Cas9系统已成为植物及其以外基因编辑的强大工具。 我们已经开发了植物载体系统，用于拟南芥中多达两个不同靶位点的基因的目标Cas9依赖性诱变。 该方案描述了对于含有Cas9和sgRNA的基因的单个T-DNA载体的简单的1周克隆程序，以及植物中诱导突变的检测。 该方法可能适用于其他可转化植物物种。
【背景】CRISPR / Cas9系统（Cas9）提供了一种简单且广泛适用的方法来修改感兴趣的基因组区域，因此成为植物和其他生物体基因组编辑的首选工具（Schiml和Puchta，2016）。该系统依赖于可以通过短的人造单指导RNA分子（sgRNA）向基因组DNA序列引导的化脓性链球菌（Cas9）的细菌Cas9核酸酶（Jinek等人， ，2012），在那里它创建一个双链断裂（DSB）。然后通过植物细胞的固有DNA修复机制修复这些DSB。在这里，可以区分两个主要途径（Salomon和Puchta，1998）。 （i）与DSB位点高度同源的DNA分子可用作修复模板。可以利用这种同源性定向修复（HDR）方法在DSB的现场引入特定的序列（Schiml等人，2014; Baltes and Voytas，2015）。然而，由于这些序列的低融合率，植物中HDR介导的基因编辑仍然具有挑战性。 ...
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