| Precision Tagging: A Novel Seamless Protein Tagging by Combinational Use of Type II and Type IIS Restriction Endonucleases
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Author:
Date:
2018-02-05
[Abstract] Protein tagging is a powerful tool for performing comprehensive analyses of the biological functions of a protein of interest owing to the existence of a wide variety of tags. It becomes indispensable in some cases, such as in tracking protein dynamics in a live cell or adding a peptide epitope due to the lack of optimal antibodies. However, efficiently integrating an array of tags into the gene of interest remains a challenge. Traditional DNA recombinant technology based on type II restriction endonucleases renders protein tagging tedious and inefficient as well as the introduction of an unwanted junction sequence. In our attempt to tag Thrombospondin type 1 domain-containing 1 (THSD1) that we identified as the first intracranial aneurysm gene (Santiago-Sim et al., 2016), we ...
[摘要] 由于各种标签的存在，蛋白质标签是一种对感兴趣的蛋白质的生物学功能进行全面分析的有力工具。在某些情况下，例如跟踪活细胞中的蛋白质动态变化或由于缺乏最佳抗体而添加肽表位，这变得不可或缺。然而，将一系列标签有效地整合到感兴趣的基因中仍然是一个挑战。基于II型限制性内切核酸酶的传统DNA重组技术使得蛋白质标记繁琐且效率低下以及引入不需要的连接序列。我们试图标记我们确定为第一个颅内动脉瘤基因的血小板反应蛋白1型结构域1（THSD1）（Santiago-Sim等人，2016），我们开发了一种新型精确标记技术，组合使用II型和IIS限制性核酸内切酶（Xu等人，2017），其产生高效率的无缝克隆。在这里，我们描述了一个协议，不仅为任何感兴趣的基因提供了一个广义的策略，而且还将THSD1中的11个不同标签的应用作为一个循序渐进的例子。
【背景】具有不同特征的多功能标签可以作为一组分析蛋白质功能的工具。诸如绿色荧光蛋白（GFP）标签及其衍生物，串联亲和纯化标签（如FLAG-HA或ProtA-CBP）的各种标签多年来革新了生物学研究。一些新开发的化学标签，如SNAP或CLIP，允许以时间控制的方式有条件地标记感兴趣的蛋白质（Bodor等人，2012）。然而，有效地将尽可能多的不同标签整合到感兴趣的基因中的方法发展不足。
传统的DNA重组利用识别回文序列的II型限制性内切核酸酶。例如，Eco ...
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| Generation of Targeted Knockout Mutants in Arabidopsis thaliana Using CRISPR/Cas9
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Author:
Date:
2017-07-05
[Abstract] The CRISPR/Cas9 system has emerged as a powerful tool for gene editing in plants and beyond. We have developed a plant vector system for targeted Cas9-dependent mutagenesis of genes in up to two different target sites in Arabidopsis thaliana. This protocol describes a simple 1-week cloning procedure for a single T-DNA vector containing the genes for Cas9 and sgRNAs, as well as the detection of induced mutations in planta. The procedure can likely be adapted for other transformable plant species.
[摘要] CRISPR / Cas9系统已成为植物及其以外基因编辑的强大工具。 我们已经开发了植物载体系统，用于拟南芥中多达两个不同靶位点的基因的目标Cas9依赖性诱变。 该方案描述了对于含有Cas9和sgRNA的基因的单个T-DNA载体的简单的1周克隆程序，以及植物中诱导突变的检测。 该方法可能适用于其他可转化植物物种。
【背景】CRISPR / Cas9系统（Cas9）提供了一种简单且广泛适用的方法来修改感兴趣的基因组区域，因此成为植物和其他生物体基因组编辑的首选工具（Schiml和Puchta，2016）。该系统依赖于可以通过短的人造单指导RNA分子（sgRNA）向基因组DNA序列引导的化脓性链球菌（Cas9）的细菌Cas9核酸酶（Jinek等人， ，2012），在那里它创建一个双链断裂（DSB）。然后通过植物细胞的固有DNA修复机制修复这些DSB。在这里，可以区分两个主要途径（Salomon和Puchta，1998）。 （i）与DSB位点高度同源的DNA分子可用作修复模板。可以利用这种同源性定向修复（HDR）方法在DSB的现场引入特定的序列（Schiml等人，2014; Baltes and Voytas，2015）。然而，由于这些序列的低融合率，植物中HDR介导的基因编辑仍然具有挑战性。 ...
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