| A Modified Low-quantity RNA-Seq Method for Microbial Community and Diversity Analysis Using Small Subunit Ribosomal RNA
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Author:
Date:
2018-05-05
[Abstract] We propose a modified RNA-Seq method for small subunit ribosomal RNA (SSU rRNA)-based microbial community analysis that depends on the direct ligation of a 5’ adaptor to RNA before reverse-transcription. The method requires only a low-input quantity of RNA (10-100 ng) and does not require a DNA removal step. Using this method, we could obtain more 16S rRNA sequences of the same regions (variable regions V1-V2) without the interference of DNA in order to analyze OTU (operational taxonomic unit)-based microbial communities and diversity. The generated SSU rRNA sequences are also suitable for the coverage evaluation for bacterial universal primer 8F (Escherichia coli position 8 to 27), which is commonly used for bacterial 16S rRNA gene amplification. The modified RNA-Seq method will ...
[摘要] 我们提出了一种用于小亚基核糖体RNA（SSU rRNA）的微生物群落分析的经修改的RNA-Seq方法，其依赖于在逆转录之前将5'衔接子直接连接至RNA。 该方法仅需要低输入量的RNA（10-100ng），并且不需要DNA去除步骤。 使用这种方法，我们可以在不受DNA干扰的情况下获得相同区域（可变区V1-V2）的更多16S rRNA序列，以便分析OTU（经营分类单元）的微生物群落和多样性。 所产生的SSU rRNA序列也适用于通常用于细菌16S rRNA基因扩增的细菌通用引物8F（大肠杆菌8至27位）的覆盖度评估。 修改的RNA-Seq方法将有助于确定各种环境样品的潜在活性微生物群落结构和多样性，并且还可用于鉴定新型微生物类群。
【背景】核糖体RNA（rRNA）占总微生物RNA的90％以上，适合微生物群落分析作为合成蛋白质的微生物生理活性指标（Blazewicz et。，2013年）。微生物群落转录物（包括rRNA和mRNA）在特定环境（双RNA转录组学）中的研究在提供微生物功能和分类信息方面具有优势（Urich等人，2008年）未能进行基于OTU的社区比较。尽管当分析凝胶提取的SSU rRNA时，可以使用16S rRNA序列的V3区来计算和比较多样性指数，但是发现仅有三分之一的所得16S ...
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| Tagged Highly Degenerate Primer (THDP)-PCR for Community Analysis of Methane- and Ammonia-oxidizing Bacteria Based on Copper-containing Membrane-bound Monooxygenases (CuMMO)
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Author:
Date:
2017-06-20
[Abstract] We describe a two-step PCR strategy using tagged highly degenerate primer (THDP-PCR) targeting copper-containing membrane-bound monooxygenases (CuMMO) genes for community analysis of methane- or ammonia-oxidizing bacteria. This strategy consists of a primary CuMMO gene-specific PCR followed by a secondary PCR with a tag as a single primer. This strategy remarkably increases the divergence of CuMMO gene amplicons while maintaining PCR efficiency without obvious amplification bias. This THDP-PCR strategy can be extended to other functional gene-based community analysis with design of new highly degenerate primer covering target functional gene sequences.
[摘要] 我们描述了使用标记的高度简并引物（THDP-PCR）的靶向含铜膜结合单加氧酶（CuMMO）基因进行甲烷或氨氧化细菌的社区分析的两步PCR策略。 该策略由初级CuMMO基因特异性PCR组成，随后是标签作为单一引物的二次PCR。 这种策略显着增加了CuMMO基因扩增子的分歧，同时保持了PCR效率，而没有明显的放大偏差。 这种THDP-PCR策略可以扩展到其他基于功能的基于基因的社区分析，并设计了覆盖目标功能基因序列的新的高度简并引物。
【背景】CuMMO超家族中的基因类型是不同的，现有的引物组只能覆盖一些CuMMO类型（Tuomivirta等，2009）。 为了覆盖CuMMO超家族中不同类型的基因，高度退化的引物是不可避免的，但是当应用于环境样品时，使用高度简并引物的以前策略具有局限性，如低PCR效率或非特异性扩增（Ledeker和De Long，2013）。 我们最近采用了两步PCR PCR方法，标记的高度简并引物，命名为THDP-PCR，扩增了CuMMO家族中广泛的基因，其PCR效率令人满意，没有明显的放大偏差（Wang et al。，2017）。
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