Optogenetic Tuning of Protein-protein Binding in Bilayers Using LOVTRAP
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Author:
Date:
2020-09-05
[Abstract] Modern microscopy methods are powerful tools for studying live cell signaling and biochemical reactions, enabling us to observe when and where these reactions take place from the level of a cell down to single molecules. With microscopy, each cell or molecule can be observed both before and after a given perturbation, facilitating better inference of cause and effect than is possible with destructive modes of signaling quantitation. As many inputs to cell signaling and biochemical systems originate as protein-protein interactions near the cell membrane, an outstanding challenge lies in controlling the timing, location and the magnitude of protein-protein interactions in these unique environments. Here, we detail our procedure for manipulating such spatial and temporal protein-protein ...
[摘要] [摘要] 现代显微镜方法是研究活细胞信号转导和生化反应的强大工具,使我们能够观察这些反应的时间和位置,从细胞水平到单个分子。利用显微镜,可以在给定的扰动之前和之后观察每个细胞或分子,比起破坏性的信号定量方法,可以更好地推断因果关系。由于细胞信号传导和生化系统的许多输入源于细胞膜附近的蛋白质-蛋白质相互作用,因此一个巨大的挑战在于控制时间,位置 以及这些独特环境中蛋白质与蛋白质相互作用的程度。在这里,我们详细介绍了在封闭的显微镜系统中使用这种基于时空的蛋白质-蛋白质相互作用系统,在支持的脂质双分子层上使用基于LOVTRAP的光反应性蛋白质-蛋白质相互作用系统的程序。系统可以在几秒钟内做出响应,并且可以将细节图案化到1微米级别。我们使用了该技术来解锁T细胞信号传导的基本方面,并且该方法可推广到许多其他细胞信号传导和生化环境。
背景技术细胞信号传导和细胞生物学中的问题通常集中在细胞如何感知和响应其环境上。进行这些细胞决定的信号级联反应包含的蛋白质可以在几秒钟到几分钟的时间内将纳米级移动到微米级。某些常用方法,例如蛋白质印迹,qPCR ...
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Fluorophore Labeling, Nanodisc Reconstitution and Single-molecule Observation of a G Protein-coupled Receptor
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Author:
Date:
2017-06-20
[Abstract] Activation of G protein-coupled receptors (GPCRs) by agonist ligands is mediated by a transition from an inactive to active receptor conformation. We describe a novel single-molecule assay that monitors activation-linked conformational transitions in individual GPCR molecules in real-time. The receptor is site-specifically labeled with a Cy3 fluorescence probe at the end of trans-membrane helix 6 and reconstituted in phospholipid nanodiscs tethered to a microscope slide. Individual receptor molecules are then monitored over time by single-molecule total internal reflection fluorescence microscopy, revealing spontaneous transitions between inactive and active-like conformations. The assay provides information on the equilibrium distribution of inactive and active receptor conformations and ...
[摘要] 通过激动剂配体激活G蛋白偶联受体(GPCR)是通过从无活性受体构象向活性受体构象的转变来介导的。我们描述了一种新颖的单分子测定法,可以实时监测单个GPCR分子中的激活连锁构象转换。受体在跨膜螺旋6末端用Cy3荧光探针进行位点特异性标记,并在连接到显微镜载玻片的磷脂纳米圆盘中重构。然后通过单分子全内反射荧光显微镜随时间监测单个受体分子,显示无活性和活性样构象之间的自发转变。该测定提供关于无活性和活性受体构象的平衡分布以及构象交换的速率常数的信息。实验可以在不存在配体的情况下进行,显示负责基础信号传导活动的自发构象过渡,或者存在激动剂或反向激动剂配体,揭示配体如何改变受体的动力学刺激或抑制信号传导活性。所得到的机械信息对于改进的GPCR靶向药物的设计是有用的。单分子测定法在β2肾上腺素能受体的背景下进行了描述,但可扩展到多种GPCRs。 【背景】GPCR介导本地和远距离的细胞通讯,特别是内分泌系统。例如,细胞对激素如肾上腺素的反应是通过肾上腺素能受体介导的,其中β2肾上腺素能受体(β2AR)是突出的成员。 ...
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