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Author:
Date:
2018-07-20
[Abstract] After recognizing extracellular bacterial lipopolysaccharide (LPS), the toll-like receptor 4 (TLR4)-CD14 signaling complex initiates two distinct signaling pathways–one from the plasma membrane and the other from the signaling endosomes (Kagan et al., 2008). Understanding the early stages of TLR4 signal transduction therefore requires a robust and quantitative method to measure LPS-triggered TLR4 and CD14 receptor endocytosis, one of the earliest events of LPS detection. Here, we describe a flow cytometry-based method that we used recently to study the role of the ion channel TRPM7 in TLR4 endocytosis (Schappe et al., 2018). The assay relies on stimulating the cells with LPS and measuring the cell surface levels of TLR4 (or CD14) at various time points using flow ...
[摘要] 在识别细胞外细菌脂多糖（LPS）后，Toll样受体4（TLR4）-CD14信号传导复合物启动两种不同的信号传导途径 - 一种来自质膜，另一种来自信号传导内体（Kagan 等。，2008）。因此，了解TLR4信号转导的早期阶段需要一种稳健且定量的方法来测量LPS触发的TLR4和CD14受体内吞作用，这是LPS检测中最早发生的事件之一。在这里，我们描述了一种基于流式细胞术的方法，我们最近用它来研究离子通道TRPM7在TLR4内吞作用中的作用（Schappe et al。，2018）。该测定依赖于用LPS刺激细胞并使用流式细胞术在不同时间点测量TLR4（或CD14）的细胞表面水平。尽管我们详细描述了来自鼠骨髓来源的巨噬细胞的TLR4和CD14的方法，但它可以很容易地适应于在各种其他信号传导环境中评估受体内吞作用。
【背景】先天免疫细胞，包括巨噬细胞和树突细胞，使用各种模式识别受体（PRR）来调查其环境中的危险和病原体相关分子模式。来自各种亚细胞区室的PRR的贩运和信号传导实现了更广泛的免疫监视，并且已成为先天免疫的重要设计原则（Brubaker et al。，2015）。细菌内毒素LPS的检测高度依赖于TLR4及其共同受体CD14。 TLR4复合物的内吞作用需要CD14，并且对于LPS诱导的巨噬细胞活化是必需的（Zanoni 等人，2011; Tan ...
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Date:
2017-06-20
[Abstract] Efficient delivery of oligonucleotide therapeutics, i.e., siRNAs, to the central nervous system represents a significant barrier to their clinical advancement for the treatment of neurological disorders. Small, endogenous extracellular vesicles were shown to be able to transport lipids, proteins and RNA between cells, including neurons. This natural trafficking ability gives extracellular vesicles the potential to be used as delivery vehicles for oligonucleotides, i.e., siRNAs. However, robust and scalable methods for loading of extracellular vesicles with oligonucleotide cargo are lacking. We describe a detailed protocol for the loading of hydrophobically modified siRNAs into extracellular vesicles upon simple co-incubation. We detail methods of the workflow from ...
[摘要] 将寡核苷酸治疗剂即siRNAs有效递送到中枢神经系统代表了治疗神经系统疾病的临床进展的显着障碍。 小的内源性细胞外囊泡显示能够在细胞（包括神经元）之间传输脂质，蛋白质和RNA。 这种天然的贩运能力使细胞外囊泡成为寡核苷酸即siRNA的递送载体的潜力。 然而，缺乏用寡核苷酸载体装载细胞外囊泡的稳健和可扩展的方法。 我们描述了在简单共孵育后将疏水修饰的siRNA加载到细胞外囊泡中的详细方案。 我们详细介绍了从细胞外囊泡纯化到数据分析的工作流程。 该方法可以促进基于细胞外基于囊泡的疗法用于治疗广泛的神经障碍。
【背景】siRNA是一种类型的寡核苷酸治疗剂，一类新的直接靶向信使RNA（mRNA）的药物，以防止导致疾病表型的蛋白质的表达。 siRNA的治疗应用是非常有希望的，因为siRNA可以被设计为靶向任何基因，包括不能用小分子或基于蛋白质的疗法“可药用”的基因。在寡核苷酸治疗剂的化学中取得的进展使得能够设计完全稳定的疏水改性的siRNA（hsiRNA，用2'-O-甲基或2'-氟以及硫代磷酸酯和共价键合到胆固醇的有义链修饰），其促进细胞hsiRNA的自我内化，并保持有效负载在RNA诱导的沉默复合体（RISC）中的能力（Byrne等，2013; Khvorova和Watts，2017）。与乘客链的3'末端连接的胆固醇缀合物对于快速细胞膜缔合是必需的（Byrne等，2013; ...
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